1. Przygotuj konstrukt retrowirusowy
- Subklonować łańcuchy alfa i beta receptora komórek T (TCR), oddzielone łącznikiem 2A, do wektora retrowirusowego opartego na MSCV (na przykład pMIAII lub pMIGII).
nuta: Łącznik 2A pozwala na stechiometryczną i zgodną ekspresję łańcuchów TCR alfa i beta z pojedynczej otwartej ramki odczytu. Wektor zawiera kasetę z białkiem fluorescencyjnym IRES (ametryną lub GFP), która służy do śledzenia transdukowanych komórek i wydajności transdukcji.
- Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą komercyjnie uzyskanego zestawu do przygotowania osocza lub podobnego produktu. Użyj stężenia roboczego 1-2 μg μl-1.
2. Generacja retrowirusowych linii komórkowych producentów
- Wykorzystaj dwuetapowy proces do produkcji retrowirusowych linii komórkowych producenta.
- Wygeneruj retrowirusa przez przejściową transfekcję komórek 293T z trzema plazmidami (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) i wektor będący przedmiotem zainteresowania) i weź retrowirusowy supernatant z komórek 293T w celu transdukcji ekotropowej linii komórkowej producenta retrowirusa GP + E86.
- Wyizoluj górne 40% komórek wytwarzających GP+E86 z ekspresją fluorescencyjną za pomocą FACS i rozmnażaj transdukowane komórki produkcyjne GP+E86 jako źródło wirusa.
nuta: Wytwarzanie producentów o wysokim mianie ma kluczowe znaczenie dla wydajnej transdukcji komórek szpiku kostnego.
3. Transfer genów komórek macierzystych za pośrednictwem retrowirusów (Dzień -5)
- Rozmrozić i wyhodować 0,5 -1,0 x 106 każdej linii komórkowej producenta GP+E86 w kompletnym DMEM 10% (vol/vol) FBS, aby umożliwić wystarczający wzrost dla dwóch zlewających się płytek 150-mm do dnia 0 tego protokołu.
nuta: Rozmrażanie 0,5 - 1,0 x 106 każdej linii komórkowej producenta GP+E86 na 10-centymetrowej płytce pozwoli na 30 - 50% konfluencji w dniu 5. Pozwala to również na 5 dni hodowli w celu rozszerzenia linii komórkowych producentów GP+E86 do dwóch zlewających się płytek o średnicy 150 mm do dnia 0.
- Hodowla retrowirusowej linii komórkowej producenta w kompletnych pożywkach do hodowli tkankowych zawierających 5% płodowej surowicy cielęcej i cyprofloksacynę (10 μg/ml) w celu uniknięcia zanieczyszczenia mykoplazmą.
nuta: Należy zaprzestać stosowania cyprofloksacyny podczas wytwarzania supernatantu wirusa do transdukcji szpiku kostnego. Należy unikać nadmiernego wzrostu linii komórkowej producenta, ponieważ wpłynie to negatywnie na wydajność transdukcji szpiku kostnego.
4. Retrowirusowa hodowla komórkowa producenta (Dzień 0)
- Płytka: 3 x 10,6 retrowirusowych komórek producenckich na płytce 150 mm w 18 ml kompletnym DMEM 20% (vol/vol) FBS.
- Inkubować retrowirusowe komórki produkcyjne w temperaturze 37 °C przez noc. Należy przewidzieć jedną 150-milimetrową płytkę na 15 milionów komórek szpiku kostnego (około 2-3 myszy dawcy).
5. Retrowirusowy supernatant (Dzień 1)
- Następnego dnia (około 24 godziny później) należy pobrać retrowirusowy supernatant z płytek producenta (ustawionych w kroku 4), pobierając retrowirusowy supernatant bezpośrednio z płytki o średnicy 150 mm za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
- Ostrożnie zastąpić usunięty retrowirusowy supernatant 18 ml świeżego kompletnego DMEM 20% (vol/vol) FBS.
- Uzupełnij przefiltrowany supernatant retrowirusowy IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) i bromkiem heksadimetryny (polibren) (6 μg ml-1).
nuta: Bromek heksadimetryny powinien być świeży co 2 miesiące, aby uniknąć spadku skuteczności transdukcji retrowirusowej.
6. Retrowirusowy supernatant i transdukcja (Dzień 2)
- Po 24 godzinach pobrać świeży supernatant wirusa z linii komórkowej producenta wirusa. Przefiltrować retrowirusowy supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm. Uzupełnij przefiltrowany supernatant retrowirusowy o IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) i SCF (50 g ml-1) oraz bromek heksadimetryny (6 g ml-1).
- Następnie ostrożnie wyjąć pipetą lub odessać górne 2 ml pożywki z każdego dołka sześciodołkowej płytki zawierającej komórki szpiku kostnego.
nuta: Pracuj ostrożnie, aby nie zasysać szpiku kostnego, który zwykle koncentruje się w środku studzienki. Alternatywnie, usunięty supernatant można odwirować w celu odzyskania utraconych komórek szpiku kostnego.
- Do każdej studzienki w 6-dołkowej płytce szpiku kostnego dodać 3 ml świeżego supernatantu wirusowego zawierającego cytokiny i bromek heksadimetryny. Zawinąć płytki w folię foliową i powtórzyć transdukcję wirowania przy 1 000 x g przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Rozpakować płytki i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc (około 24 godzin).
7. Dodanie świeżo uzupełnionego DMEM (Dzień 3)
- Po upływie 24 godzin usunąć górne 2 ml pożywki z każdej studzienki z sześciodołkowej płytki zawierającej komórki szpiku kostnego, jak w kroku 6.2. Zastąp usunięte podłoże świeżym DMEM 20% (vol/vol) FBS uzupełnionym końcowymi stężeniami IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) i SCF (50 g ml-1).
- Inkubować płytki szpiku kostnego w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cprzez kolejne 24 godziny.
