Barwienie czerwienią olejową O: technika barwienia obojętnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby in vitro

Streszczenie

Źródło: Campos-Espinosa, A. et al., Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie demonstrujemy barwienie in vitro neutralnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby lub nadmiernego gromadzenia tłuszczu w wątrobie. Nadmiar tłuszczu gromadzi się w komórkach w postaci kropelek lipidów. Olej Red O jest rozpuszczalnym w tłuszczach barwnikiem, który wiąże się z wewnątrzkomórkowymi obojętnymi lipidami w tych kropelkach lipidów. Obserwowane pod mikroskopem świetlnym te wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów wydają się intensywnie czerwone.

Protokół

1. Barwienie lipidów za pomocą czerwieni olejowej O

1. Umieść szkiełko nakrywkowe z hodowli komórkowej w każdym dołku na płytce 24-dołkowej.
2. Wysiej 100 000 komórek HepG2 na dołek. Dodaj 1 ml standardowego RPMI 1640.
3. Wstępną inkubację w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
4. Zmień standardowe medium RPMI 1640 na podłoże stłuszczenne.
5. Inkubować przez 24 godziny, 2 dni, 3 dni i 4 dni, odświeżając pożywkę steatogeniczną co 24 godziny.
6. Po upływie odpowiedniego czasu odrzucić szwadron.
7. Przemyć 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odrzucić supernatant.
8. Utrwalić za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu w PBS.
9. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Wyrzuć nadmiar paraformaldehydu.
11. Opłucz komórki 1 ml wody destylowanej.
12. Dodać 1 ml 70% izopropanolu i inkubować przez 5 minut.
13. Odrzucić nadmiar izopropanolu. W tym momencie mycie PBS nie jest potrzebne.
14. Dodać 1 ml roztworu czerwieni olejowej O i inkubować przez 30 minut.
15. Odrzucić nadmiar roztworu O z czerwienią olejową.
16. Spłucz 1 ml wody destylowanej.
17. Dodać 500 μl roztworu hematoksyliny. Inkubować przez 3 minuty.
18. Wyrzuć nadmiar roztworu hematoksyliny.
19. Spłucz 1 ml wody destylowanej.
20. Obserwuj pod mikroskopem w powiększeniu 400x (obiektyw 40x, okular 10x).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka hodowlana RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 31800-022	-
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher-Gibco, Stany Zjednoczone	A4766801	-
Linia komórkowa HepG2	ATCC, Stany Zjednoczone	HB-8065	Rak wątrobowokomórkowy komórki ludzkie.
Inkubator nawilżany	Korporacja Termoelektroniczna, Stany Zjednoczone	Modelu: 3110	Temperatura (37 °C ± 1 °C), wilgotność (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Mikroskop odwrócony Eclipse	NIKON, JPN	Modelu: TE2000-S	-
Izopropanol	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	I9030-4L	-
Zestaw Oil Red O	Abcam, Stany Zjednoczone	ab150678	Zestaw do histologicznej wizualizacji tłuszczu obojętnego.
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P6148-500G	-
Penicylina/streptomycyna	ThermoFisher-Gibco, Stany Zjednoczone	Rozdział 15140-122	Antybiotyki 10 000 j./ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	ThermoFisher-Gibco, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy 10010-023	-
Pipety serologiczne	Sarstedt, AUS	Numer katalogowy: 86.1253.001	Nie pirogenny, sterylny, 5 ml
Pipety serologiczne	Sarstedt, AUS	Numer katalogowy: 86.1254.001	Nie pirogenny, sterylny, 10 ml
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	S5761-1KG	Przygotowanie pożywek hodowlanych
Oleinian sodu	Santa Cruz Biotechnology, Stany Zjednoczone	sc-215879A	-
Palmitynian sodu	Santa Cruz Biotechnology, Stany Zjednoczone	SC-215881	-
Trypsyna 0,05% /EDTA 0,53 mM	Corning, Stany Zjednoczone	25-052-CL	-
24-dołkowy klaster kultur komórkowych	Corning, Stany Zjednoczone	3524	Płaskie dno z pokrywką. Hodowla tkankowa poddana obróbce. Niepirogenne, polistyrenowe, sterylne. 1/opakowanie.

powiedział: powiedział: powiedział: TGL