$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fluorometryczna kwantyfikacja neutralnych lipidów za pomocą czerwieni nilowej
UWAGA: Do odczytu fluorescencji potrzebne jest tylko 10 μl zawiesiny glonów o stężeniu 5 g/L. Ogólnie rzecz biorąc, izolacja suchej biomasy glonów z 1,5 ml bulionu hodowlanego jest więcej niż wystarczająca. Również natężenie światła lampy w spektrofotometrze może z czasem ulec pogorszeniu. Zaleca się uwzględnianie wzorców w każdym eksperymencie, aby upewnić się, że zmiany w instrumencie nie dodają niepotrzebnych błędów do pomiarów.
- Przygotować roztwór czerwieni nilowej o stężeniu 10 μg/ml rozpuszczony w alkoholowym odczynniku etanolowym. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 30% (v/v) roztwór etanolu w wodzie dejonizowanej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować wszystkie próbki glonów o tym samym stężeniu biomasy (zalecane jest 5 g/l) i w taki sam sposób, jak wzorce użyte w pomiarze. W tym celu należy zawiesić wstępnie wysuszone próbki w odpowiedniej ilości buforu fosforanowego (0,6 g/l fosforanu potasu dwuzasadowego, 1,4 g/l fosforanu potasu jednozasadowego) lub dostosowując stężenie rosnącej kultury glonów do 5 g/l z buforem fosforanowym po zmierzeniu zmętnienia.
UWAGA: Pomiary wykonywane na żywych kulturach glonów często będą miały większy błąd związany z nimi w zależności od precyzji krzywej kalibracji zmętnienia. Ponowne zawieszenie wysuszonych próbek może wymagać użycia homogenizatora w celu pełnego rozproszenia biomasy.
- Dla każdej próbki wymieszać 80 μl 30% roztworu etanolu, 10 μl roztworu czerwieni nilowej i 10 μl zawiesiny glonów w jednym dołku na 96-dołkowej płytce. W celu prawidłowego uwzględnienia zmienności pomiaru fluorescencji należy wykonać 5 powtórzeń każdej próbki.
- Przeprowadź dwupunktową krzywą kalibracyjną z wzorcami, aby uwzględnić codzienne zmiany w przyrządzie i przygotowaniu. Przygotować wzorce do pomiaru fluorescencji, stosując tę samą procedurę, co próbki.
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, do ponownej kalibracji przyrządu wystarczą dwa punkty, trzy punkty można uruchomić w celu sprawdzenia liniowości.
- Wykonaj pomiary fluorescencji w spektrofotometrze z wielodołkowym czytnikiem płytek. Stwierdzono, że następujące warunki dają najbardziej spójne wyniki:
- Wstrząsać z prędkością 1 200 obr./min, orbita 3 mm, przez 30 sek.
- Inkubować w temperaturze 40 °C przez 10 minut.
- Wstrząsać z prędkością 1 200 obr./min, orbita 3 mm, przez 30 sek.
- Zapis fluorescencji, wzbudzenia przy 530 nm, emisji przy 604 nm.
- Przelicz pomiary fluorescencji na zawartość oleju, korzystając z wyników z wzorców wewnętrznych.