Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie odczynników
- Izolacja i zwapnienie mysich aort VSMC
- Roztwór do trawienia aorty:
- Przygotuj świeży roztwór (~ 3-5 ml na zebraną aortę) z Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) zawierającym 175 U/ml kolagenazy typu 2 i 1,25 U/ml elastazy. Wysterylizuj roztwór za pomocą próżniowego systemu filtracji 0,22 μm i trzymaj roztwór na lodzie do czasu użycia.
- Nośniki komórkowe:
- Uzupełnij 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przed użyciem podgrzej podłoże do 37 °C.
- Pożywki do zwapnienia:
- Pożywka do zwapnienia A (NaPhos; stosowana w liniach komórkowych myszy):
- Uzupełnij 100-500 ml DMEM (objętość w razie potrzeby) 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM fosforanu sodu, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przed użyciem podgrzej podłoże do temperatury 37 °C.
Lub
- Pożywka do zwapnienia B (βGP/Asc/DEX; stosowana w liniach komórkowych myszy lub ludzi):
- Uzupełnij 100-500 ml DMEM (objętość w razie potrzeby) 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 mM disodu β-glicerofosforanu, 50 μg/ml kwasu L-askorbinowego, 10 nM deksametazonu, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przed użyciem podgrzej podłoże do 37 °C.
2. Sekcja myszy
- Poddaj mysz eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu w dawce 200 mg/kg.
- Połóż zwierzę na wznak na desce do sekcji i ustabilizuj, przyklejając każdą łapę do deski. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i małych nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej rozciągające się od dolnej części brzucha do górnej części klatki piersiowej.
- Oderwij skórę kleszczami i usuń otrzewną, odsłaniając narządy jamy brzusznej. Usuń narządy żołądkowo-jelitowe, uważając, aby nie przeciąć aorty.
- Wykonaj boczne nacięcie w przedniej przeponie i kontynuuj nacięcie w poprzek brzucha. Za pomocą nożyczek preparacyjnych uwolnij klatkę piersiową, przecinając boki żeber i usuwając tkankę miękką przylegającą do górnej części mostka. Usuń klatkę piersiową, odsłaniając płuca.
- Początkowo pozostaw serce na miejscu (aby pomóc w identyfikacji i rozwarstwieniu bliższej aorty) i ostrożnie usuń płuca. Ostrożnie usuń grasicę, tchawicę i przełyk, upewniając się, że aorta pozostaje nienaruszona.
- Za pomocą prostych cienkich kleszczy i nożyczek do mikropreparowania usuń tkankę miękką otaczającą aortę od rozwidlenia biodrowego do łuku aorty, zwracając szczególną uwagę podczas usuwania tłuszczu okołoaortalnego (ryc. 1A). Usuń pozostały tłuszcz i tkankę miękką otaczającą duże gałęzie łuku aorty (tj. tętnice ramienno-głowowe, tętnice szyjne wspólne i podobojczykowe, ryc. 1B).
nuta: Ważne jest, aby usunąć tłuszcz z aorty, ponieważ tłuszcz może zwiększyć sygnał tła podczas wykonywania obrazowania fluorescencyjnego.
- Usuń serce z jamy klatki piersiowej, ostrożnie odłączając je od bliższej aorty i wyrzuć. Przeciąć dystalną aortę w rozwidleniu biodrowym. Za pomocą igły insulinowej wstrzyknij zwykłą sól fizjologiczną do aorty z łuku aorty, aby wypłukać pozostałe krwinki. Odłącz aortę wraz z naczyniami łuku aorty, całkowicie usuwając ją z ciała.
- Umieść aortę w normalnym roztworze soli fizjologicznej na lodzie, aż będzie gotowa do obrazowania.
3. Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń aorty mysiej
- Umieść aorty w zimnym HBSS, aż do zakończenia sekcji. Ostrożnie odetnij pozostały tłuszcz okołoaortalny i tkankę miękką, pozostawiając tylko aortę.
- Pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek przenieś aorty do roztworu do trawienia aorty w szalkach do hodowli tkanek o wymiarach 35 mm x 10 mm. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, delikatnie kołysząc z przerwami. Po strawieniu aorty mają rozciągnięty lub postrzępiony wygląd.
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i sterylnych kleszczy usuń zewnętrzną warstwę przybyszową aorty, zachowując nienaruszoną warstwę przyśrodkową. Jedną z technik usuwania przydanki jest oderwanie zewnętrznej warstwy aorty na jednym końcu i usunięcie jej z leżącej poniżej warstwy przyśrodkowej, tak jak skarpetę można odkleić i usunąć.
- Po usunięciu warstwy przybyszowej umieść pozostałą aortę w nowym naczyniu do hodowli tkankowych z pożywką do hodowli komórkowych i przechowuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2-4 godziny.
- Pod sterylnym kapturem i za pomocą sterylnych nożyczek do mikrorozwarstwienia o średnicy 3 mm przetnij aortę na pierścienie o szerokości 1-2 mm.
- Umieścić te pierścienie w nowym naczyniu do hodowli tkankowej z roztworem do trawienia aorty i inkubować w temperaturze 37 °C z delikatnym przerywanym kołysaniem przez 120 minut. Podczas tej inkubacji kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki.
- Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórek ciepłych do roztworu wytrawiającego i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Wirować probówkę przez 5 minut przy 200 x g.
- Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości pożywki do hodowli komórkowych (np. 5 ml).
- Umieścić całą ilość wyizolowanych komórek z każdej aorty w kolbie do hodowli komórkowej o średnicy 25cm2 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Rozmnażaj komórki przy użyciu standardowych technik, jak opisano wcześniej. W ciągu pierwszych 7-10 dni inkubacji należy zmieniać pożywkę co 72-96 godzin. Gdy komórki zbliżają się do konfluencji, należy uzupełniać pożywkę częściej (co 48 godzin).
nuta: Wyhodowanie wystarczającej ilości komórek może zająć wiele tygodni.
- Po zlaniu się, komórki przechodzą przez trypsynę, która jest podgrzewana do 37 °C.
- Dodać 0,5-1,0 ml trypsyny do każdej kolby hodowlanej i inkubować przez 3-5 minut; delikatnie postukać w bok kolby co 30-60 sekund, w razie potrzeby, aby oderwać komórki od powierzchni.
- Gdy komórki oderwą się od dna kolby, dodaj 10 ml pożywki komórkowej do komórek w trypszynie. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i trypsynę z osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w żądanej ilości świeżej pożywki komórkowej (np. 5-10 ml) i przenieść do nowej kolby (z niektórymi komórkami przeniesionymi na szkiełko komorowe).
- Przy pierwszym pasażu komórek potwierdź linię komórek mięśni gładkich za pomocą standardowych technik immunocytochemicznych, jak opisano wcześniej, przy użyciu przeciwciała skierowanego przeciwko aktynie α mięśni gładkich.
4. Wywoływanie zwapnienia hodowanych komórek mięśni gładkich
- Komórki płytkowe otrzymane z 3.12 w formacie 6-dołkowym.
nuta: Zaczynając od 1 x 10, zaleca się5 komórek/studzienkę w całkowitej objętości 2,0 ml pożywki komórkowej na studzienkę.
- Pozwól komórkom rosnąć w podłożu do zwapnienia A lub B przez co najmniej 7 dni w formacie płytki 6-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Zmieniaj nośnik komórkowy co 48 godzin.
5. Ocena zwapnienia VSMC za pomocą metody barwienia von Kossa
UWAGA: Metoda von Kossa do pomiaru zwapnienia macierzy zewnątrzkomórkowej tkanek lub hodowanych komórek opiera się na podstawieniu jonów wapnia związanych z fosforanami jonami srebra. W obecności światła i związków organicznych, jony srebra są redukowane i wizualizowane jako metaliczne srebro. Wszelkie nieprzereagowane srebro usuwa się przez traktowanie tiosiarczanem sodu. Protokół barwienia von Kossa jest następujący:
- Odessać pożywkę z płytek do hodowli komórkowych.
- Utrwal komórki, umieszczając je w 1 ml 10% formaliny w temperaturze pokojowej na 20 minut.
- Usuń formalinę i umyj utrwalone komórki wodą destylowaną przez 5 minut.
- Inkubować komórki w 1 ml 5% roztworu azotanu srebra pod bańką o mocy 60-100 W przez 1-2 godziny.
- Zassać roztwór azotanu srebra i przemywać wodą destylowaną przez 5 minut.
- Usunąć nieprzereagowane srebro, umieszczając komórki w 1 ml 5% roztworu tiosiarczanu sodu (w/v) w wodzie destylowanej na 5 minut.
- Płucz komórki wodą destylowaną przez 5 min. Powtórz mycie 3x. Barwnik von Kossa jest gotowy do obrazowania za pomocą standardowej mikroskopii w świetle odwróconym.
- Opcjonalny krok: Przeciwbarwić 1 ml szybko czerwonego jądra przez 5 minut. Następnie wykonaj trzy płukania wodą destylowaną (każde po 5 minut).
