$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Protokół barwienia eozyny
- Aby utrwalić próbki tkanek miękkich, napełnij probówkę wirówkową o pojemności 50 ml roztworem utrwalającym zawierającym 9,5 ml 4% (v/v) roztworu formaldehydu (FA) i 0,5 ml lodowatego kwasu octowego (AA).
nuta: Przygotuj roztwór FA świeżo z 37% bezkwasowego roztworu FA stabilizowanego około 10% metanolem. Roztwór FA należy rozcieńczyć roztworem FA roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. Wybierz DPBS bez wapnia i magnezu. Rozcieńczony roztwór FA należy przechowywać nie dłużej niż jeden miesiąc. Podczas zakwaszania pH roztworu utrwalającego zmienia się z obojętnego na około 3,
ostrożność: Ponieważ FA jest toksyczny dla narządów, i rakotwórczy, stosowanie dygestoriów jest obowiązkowe i należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
- Dodaj świeżo usuniętą próbkę tkanek miękkich do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wstaw do lodówki probówkę wirówkową o pojemności 50 ml przez 24-72 godz.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
- Próbkę tkanek miękkich przemywać roztworem DPBS przez 1 godzinę.
- Aby wybarwić utrwaloną próbkę tkanek miękkich (np. całą nerkę myszy), należy umieścić tkankę miękką w 2 ml roztworu do barwienia eozyną Y i inkubować próbkę przez 24 godziny. Przechowywać próbkę na poziomej płycie wstrząsającej, aby uzyskać płynne kołysanie (ok. 60 obr./min) podczas procesu inkubacji.
nuta: Roztwór barwiący eozynę Y ma stężenie 30% (w/v) w wodzie destylowanej. Wybrać objętość roztworu barwiącego w taki sposób, aby próbka była całkowicie pokryta roztworem barwiącym i umożliwić próbce swobodne przemieszczanie się w pojemniku na próbkę. Czas inkubacji może być różny dla innych próbek i musi być odpowiednio dostosowany.
- Po barwieniu ostrożnie wyjmij próbkę tkanek miękkich z pojemnika na próbkę.
- Ostrożnie usuń nadmiar środka barwiącego za pomocą bibuły celulozowej.
- Umieścić próbkę tkanek miękkich w stożkowym pojemniku na próbkę powyżej fazy parowej etanolu w celu przechowywania i dalszego wykorzystania.
nuta: Stożkowy pojemnik na próbkę musi zawsze zawierać kilka kropli 70% (v/v) etanolu na dnie probówki, aby utrzymać wilgotność próbki tkanek miękkich i zapobiec artefaktom.