$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie roztworów barwiących
- Przefiltrować roztwór podstawowy hematoksyliny Harrisa, aby usunąć wszelkie ciała stałe, które się wytrąciły.
- Złóż filtr do kawy na pół, aby filtr utworzył stożek. Otwórz panel boczny tak, aby płyn przepływał przez filtr, umożliwiając złapanie wszelkich zanieczyszczeń.
- Umieść filtr w lejku, a lejek w szklanej butelce z podłożem. Stopniowo przelewaj bulion hematoksyliny przez filtr.
ostrożność: Hematoksylina jest niebezpieczna w przypadku kontaktu z oczami, spożycia i wdychania. Zawsze noś fartuch laboratoryjny i rękawice, a roztwór podstawowy należy przechowywać w kapturze chemicznym.
- Przygotować 0,05% HCl, dodając 125 μl 12 N HCl do 250 ml ddH2O.
- Przygotować mieszaninę roztworu eozyny Y-floksyny B, łącząc 25 ml 1% eozyny Y (aq), 2,5 ml 1% floksyny B (aq), 195 ml 95% etanolu i 1 ml lodowatego kwasu octowego w szklanej butelce. Dobrze wymieszaj przez zawirowanie i przechowuj w RT
ostrożność: Eozyna Y jest niebezpieczna w przypadku kontaktu z oczami, spożycia i wdychania. Zawsze noś fartuch laboratoryjny i rękawice, a roztwór podstawowy należy przechowywać w kapturze chemicznym.
- Przygotuj 2% etanolu, dodając 2 ml czystego alkoholu etylowego do 98 ml wody jajecznej.
ostrożność: Alkohol etylowy działa drażniąco na oczy. Zawsze noś odpowiedni sprzęt ochronny podczas pracy z alkoholem etylowym. Jest również łatwopalny i należy się z nim odpowiednio obchodzić i przechowywać.
UWAGA: Przygotuj świeży 2% etanol za każdym razem przed przeprowadzeniem ostrej kuracji etanolem.
2. Barwienie skrawków parafiny hematoksyliną i eozyną
- Odparafinować szkiełka, zanurzając je w 100% ksylenie na 15 minut; zmień je na świeże 100% ksylenu na kolejne 15 minut.
- Ponownie nawodnij szkiełka, zanurzając je w następujących seriach sortowanego etanolu, aż płyn będzie czysto spływał ze szkiełek. Dla każdego roztworu zanurz 8-10 razy, 2 s na zanurzenie: 100% etanolu, 100% etanolu, 95% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu, 50% etanolu, 30% etanolu i wody dejonizowanej.
nuta: W tym miejscu można przerwać protokół, a zjeżdżalnie można pozostawić w RT w wodzie na kilka godzin. W razie potrzeby szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C w wodzie O/N.
- Umieść szkiełka w 100% przefiltrowanej hematoksylinie Harrisa na 4 minuty. Natychmiast przenieś je z powrotem do pojemnika z wodą dejonizowaną. Wlej wodę dejonizowaną do tylnego rogu pojemnika najbardziej oddalonego od sekcji. Okresowo opróżniaj pojemnik, aż woda przestanie być fioletowa.
nuta: Nie pozwól, aby woda spływała bezpośrednio na zjeżdżalnie, ponieważ sekcje mogą spaść ze zjeżdżalni.
- Szybko sprawdzić intensywność hematoksyny pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą lamp na gęsiej szyi; nie dopuścić do wyschnięcia szkiełek. Jeśli plama osiągnęła pożądaną intensywność, przejdź do następnego kroku. Jeśli kolor nie jest wystarczająco ciemny, umieść szkiełka w 100% hematoksylinie na 1 minutę i powtórz mycie wodą przed ponownym sprawdzeniem.
nuta: Hematoksylina musi być wystarczająco ciemna, aby kolor nie został utracony podczas barwienia eozyną. Jeśli jednak w cytoplazmie widoczne jest barwienie hematoksyliną, skrawki są przebarwione.
- Zanurz szkiełka dwukrotnie w 0,05% HCl i natychmiast przenieś je z powrotem do pojemnika z czystą wodą dejonizowaną. Opróżnij wodę i dwukrotnie napełnij pojemnik wodą.
- Przenieś szkiełka do 95% etanolu na 30 s, a następnie przenieś je do nowego pojemnika z 95% etanolem na 30 s.
- Umieść szkiełka w roztworze eozyny Y-Phloxine B na 2 minuty. Przenieś szkiełka z powrotem do poprzedniego pojemnika na 95% etanol i szybko sprawdź intensywność koloru pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli barwienie jest wystarczające, przejdź do następnego kroku. Jeśli nie, wróć do roztworu eozyny na 30 sekund, sprawdź ponownie i powtórz w razie potrzeby.
nuta: Wystarczające zabarwienie eozyną jest jasnoróżowe i pojawia się w wyraźnym kontraście z barwieniem hematoksyliną. Pamiętaj, aby wytrzeć roztwór z tylnej części szkiełek podczas sprawdzania pod mikroskopem, aby nie zaobserwowano fałszywego koloru. Ponieważ eozyna składa się w 95% z etanolu, dłuższe okresy czasu w 95% etanolu podczas sprawdzania intensywności koloru mogą wypłukać część koloru.
- Przenieś szkiełka do 100% izopropanolu na 15 s. Zastąp je świeżym 100% izopropanolem i umieść szkiełka z powrotem w izopropanolu na kolejne 15 sekund. Powtórz ten proces, w sumie 6 płukań izopropanolem.
ostrożność: Izopropanol działa drażniąco na oczy i drogi oddechowe. Zawsze upewnij się, że nosisz odpowiedni sprzęt ochronny i unikaj rozpryskiwania. Jest również wysoce łatwopalny i powinien być odpowiednio przechowywany i obchodzony z nim.
nuta: Aby zaoszczędzić na odczynnikach, wyrzuć tylko pierwsze (najbardziej różowe) mycie izopropanolem. Pozostałe pięć roztworów myjących należy przechowywać w butelkach o numerach od 1 do 5, aby można je było ponownie wykorzystać do następnego barwienia. W przypadku ponownego użycia prania zacznij od butelki o numerze "1" i wyrzuć po użyciu. Po użyciu prania "2" wlej go do butelki "1" i tak dalej. Końcowe pranie powinno być zawsze świeżym izopropanolem.
- Umieść szkiełka w 100% ksylenach na 3 minuty. Usuń po jednym szkiełku na raz i umieść szkiełko nakrywkowe.
- Dodaj wystarczającą ilość materiału montażowego, aby przykryć sekcje i zanurz je w 100% ksylenie.
nuta: Ten krok wygładzi powierzchnię medium montażowego i usunie wszelkie pęcherzyki.
- Nałóż szkiełko nakrywkowe na spód szkiełka.
nuta: Medium montażowe powinno wciągnąć suwak na miejsce. Jeśli szkiełko nakrywkowe nie jest proste lub całkowicie osadzone, delikatnie wbij je na miejsce.
- Zetrzyj nadmiar podłoża montażowego na ręczniku papierowym, aż będzie widoczna tylko cienka linia. Zanurz chusteczkę higieniczną w ksylenie i wytrzyj tylną część szkiełka, aby usunąć wszelkie medium, które kapało. Umieść szkiełko płasko na stabilnej, ale ruchomej powierzchni, takiej jak kawałek kartonu. Nakryj wszystkie pozostałe szkiełka w ten sam sposób. Pozwól ksylenowi odparować w okapie przez 10 minut.
nuta: Wszelkie materiały zanieczyszczone ksylenem należy usunąć i wyrzucić do szczelnie zamkniętego pojemnika w okapie, aby zapobiec wydostawaniu się oparów.
- Poczekaj, aż medium montażowe stwardnieje w RT O/N.
3. Obrazowanie i przechowywanie poplamionych preparatów
- Wycinki obrazu w złożonym mikroskopie odwróconym.
nuta: Szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony.