Barwienie błękitem metylenowym w celu oceny tworzenia się kolonii przerzutowych in vitro: procedura barwienia w celu oceny przerzutów poprzez ilościowe oznaczanie pobranych komórek rakowych z mysiego modelu raka

Streszczenie

Źródło: Nagai-Singer, M. A., et al. Wykorzystanie komputerowej analizy obrazu w celu poprawy kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia błękitem metylenowym w celu ilościowego określenia obciążenia przerzutami poprzez liczenie barwionych kolonii uzyskanych przez hodowlę komórek rakowych pobranych z odległych organów modelu myszy po wstrzyknięciu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przetwarzanie tkanek

UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji powinny być wykonane przy użyciu sterylnej techniki.

1. Oznaczyć 1 stożkową probówkę o pojemności 15 ml na mysz i dodać 2,5 ml mieszaniny kolagenazy typu IV i 30 jednostek elastazy do każdej probówki. Aby przygotować mieszaninę kolagenazy typu IV, rozpuść 2 mg kolagenazy typu IV na ml 1x HBSS i sterylny filtr. Można go przechowywać do 12 miesięcy w temperaturze -20 °C i w razie potrzeby rozmrozić.
2. Przenieś pobrane płuco myszy do drugiego, czystego 1x dołka HBSS dla tej próbki. Zawiruj za pomocą kleszczy, aby usunąć pozostałą krew. Przenieść czyste płuco na pustą płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 3,5 cm. Zmiel płuco nożyczkami. Przepłucz płytkę 2,5 ml 1x HBSS, przenieś 1x HBSS i kawałki płuc do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej już koktajl kolagenazy/elastazy (łącznie 5 ml).
3. Inkubować przez 75 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie kontynuować mieszanie próbek, a więc umieścić probówki na wahaczu lub obracającym się kole. Podczas tego etapu inkubacji oznacz 50 ml probówek wirówkowych i 10 cm płytek do hodowli tkankowych dla każdej myszy. Jeśli wykonujesz rozcieńczenie, oznacz wystarczającą ilość 10 cm płytek do hodowli tkankowych na rozcieńczenia.
   nuta: Oznaczyć pokrywkę płytek do hodowli tkankowych. W przypadku etykietowania samej tabliczki napis będzie zakłócał analizę Fiji-ImageJ.
4. Doprowadzić objętość każdej probówki do 10 ml za pomocą 1x HBSS. Wlać zawartość przez sitko o wielkości 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dla każdej próbki. Użyj tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, aby delikatnie zmielić próbkę przez sitko, aby umożliwić przefiltrowanie większej liczby komórek.
5. Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej (RT). Wyrzucić supernatant i przepłukać osad 10 ml 1x HBSS. Powtórz ten krok dwukrotnie.
6. Zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej 60 μM 6TG, RPMI lub IMDM. Próbki należy rozmieścić na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych, w razie potrzeby stosując schemat rozcieńczania. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 5 dni.
   UWAGA: 1:2, 1:10 i 1:100 to typowe rozcieńczenia, które będą musiały zostać empirycznie określone na podstawie parametrów badania.
   UWAGA: 6TG jest toksyczny. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się i postępuj zgodnie ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa dotyczącymi utylizacji.

2. Płytki do barwienia

1. Wlać pożywkę hodowlaną z płytek do odpowiedniego pojemnika na odpady. Utrwalić komórki, dodając 5 ml nierozcieńczonego metanolu na płytkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że metanol wiruje tak, aby pokrył całą płytkę.
   ostrożność: Metanol jest niebezpieczny w przypadku spożycia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Do tego kroku użyj dygestorium.
2. Wlej metanol z talerzy do odpowiedniego pojemnika na odpady. Opłucz płytki 5 ml wody destylowanej na płytkę i wlej wodę do odpowiedniego pojemnika na odpady. Dodać 5 ml 0,03% błękitu metylenowego na płytkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwór błękitu metylenowego jest zawirowany tak, aby pokrył całą płytkę.
3. Wlej błękit metylenowy do odpowiedniego pojemnika na odpady. Ponownie opłucz płytki 5 ml wody destylowanej na płytkę. Odwróć talerze do góry nogami i ocieraj się o ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść talerz na pokrywie i pozostaw do wyschnięcia na noc w temperaturze RT.
   nuta: Kolonie przerzutowe będą niebieskie. Po wysuszeniu płytki można je przechowywać w RT przez czas nieokreślony.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
metanol	Fisher Naukowy	A412SK-4
Błękit metylenowy	Sigma-Aldrich	03978-250ML
RMPI-1640 Średni	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2001
Wahacz lub koło obrotowe	jakikolwiek	jakikolwiek
Sterylny filtr jednorazowy z membraną PES	ThermoFisher Naukowy	568-0010
Kolagenaza typu IV	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C5138
Płytki do hodowli tkankowych 3,5 cm	Nunclon	153066
Płytki do hodowli tkankowych 10 cm	Fisher Naukowy	08-772-22
Probówka wirówkowa 15 ml	Fisher Naukowy	14-959-70C
1X Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
Probówka wirówkowa 50 ml	Fisher Naukowy	14-959-49A
Sitko do komórek 70 μM	Fisher Naukowy	22-363-548
70% etanolu	Sigma Aldrich	E7023	Rozcieńczyć do 70% wodą DI
inkubator			Musi być zdolny do emisji 5%CO2 i 37 °C
Kleszcze	Roboz powiedział:	Złącze RS-8100
wirówka	jakikolwiek	jakikolwiek	Musi być w stanie 125 x g i 300 x g
woda destylowana	jakikolwiek	jakikolwiek
Elastaza	MP Biomedycyna	100617

powiedział: