Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja PBMC z krwi pełnej
UWAGA: Przeprowadź tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając sterylnej techniki i sprzętu wysterylizowanego przez producenta.
- Ostrożnie wlej 10-15 ml krwi pełnej z probówek do pobierania krwi heparynizowanej (antykoagulantowej) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W przypadku drobnych rozlanych wycieków krwi przetrzyj ddH2O i 70% EtOH za pomocą chusteczki czyszczącej.
- Rozcieńczyć krew w stożkowej probówce w stosunku 1:1 roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS 1x) o pH 7,4. Upewnij się, że maksymalna całkowita objętość nie przekracza 30 ml.
- Delikatnie wymieszać za pomocą serologicznego pistoletu do pipet, unikając pęcherzyków powietrza.
nuta: NIE mieszać przez odwrócenie probówki, aby uniknąć gromadzenia się krwi w nasadce i późniejszego przesiąkania podczas wirowania.
- Dodać 13 ml Ficoll-paque (patrz tabela materiałów) do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Trzymaj rurkę pionowo w stojaku.
- Za pomocą pipety transferowej pobrać rozcieńczoną krew, dotknąć końcówki pipety transferowej do wewnętrznej ścianki rurki w pobliżu góry. Z powolnym i stałym ciśnieniem przenieś krew wzdłuż wewnętrznej ścianki rurki, tworząc warstwę krwi na wierzchu warstwy sacharozy. Wykonaj ten krok kilka razy, aż cała krew zostanie przeniesiona.
- Szczelnie zamknij probówkę i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 700 x g w wirniku obrotowym ze średnim przyspieszeniem ustawionym na 5 i opóźnieniem ustawionym na ZERO.
- Powoli wyjmij probówkę i nie naruszając warstw, zanieś ją z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
- Ostrożnie zebrać kożuchową powłokę (cienką, mętną białą warstwę), w której znajdują się PBMC, umieszczoną między warstwami PBS/plazmy i fikolu za pomocą pipety transferowej. Unikaj zbierania warstwy sacharozy i nie naruszaj warstwy czerwonych krwinek.
- Przenieś kożuchową powłokę do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Może minąć kilka razy powtórzenie kroku 1.8 w celu zebrania wszystkich PBMC.
- Dodać PBS pH 7,4 do probówki z PBMC i napełnić do oznaczenia 45 ml. Dokładnie wstrząśnij tubką. Nie wirować.
- Mycie 1: Wirować przez 15 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9. Obserwuj tworzenie się osadu PBMC na dnie stożkowej rurki.
- Wylać PBS (supernatant) do plastikowej zlewki z 10 ml wybielacza.
- Poluzuj granulat komórkowy, delikatnie "uderzając" o pofałdowaną powierzchnię (tj. Pusty stojak). Nie wirować.
- Do probówki dodać 25 ml świeżego PBS o pH 7,4. Jeśli przetwarzana jest więcej niż jedna probówka, na tym etapie połącz pelety.
- Mycie 2: Wirować probówkę przez 12 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9.
- Wylać PBS (supernatant) do plastikowej zlewki z odrobiną wybielacza.
- Delikatnie "stojak" na pofałdowanej powierzchni (tj. pustym stojaku). Nie wirować.
- Dodać 25 ml świeżego PBS do probówki.
- Wyjmij 50 μl komórek i przenieś do probówki mikrowirówkowej w celu zliczenia żywotności.
- Dodać równą ilość (50 μl) błękitu trypanowego (barwnik o żywotności) i delikatnie wymieszać, pipetować w górę i w dół.
- Pobrać 10 μl i przenieść je do hemocytometru, aby sprawdzić żywotność komórek na ml. Zapisać liczbę komórek/ml.
- Wyjmij żądaną ilość komórek i odwiruj probówkę przez 12 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9.
- Wylać PBS (supernatant) do zlewki z wybielaczem.
- Delikatnie "stojak" na pofałdowanej powierzchni (tj. pustym stojaku). Dodać 80 μl PBS do probówki.
2. Tworzenie zjeżdżalni PBMC
- Umieścić 80 μl komórek na szkiełku mikroskopowym. Rozsmaruj kroplę za pomocą innego szkiełka lub umieść 2 krople po 40 μl każda na obu końcach szkiełka.
- Pozostaw szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia. Oznacz szkiełko ołówkiem po matowej stronie.
3. Utrwalanie próbek na slajdach
- Przygotować roztwór utrwalający, mieszając 0,5 ml 37% formaldehydu z 4,5 ml 99% etanolu.
- Po wysuszeniu szkiełek należy wyjąć 2 ml świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego i wylać go na szkiełko tak, aby pokryć całą powierzchnię szkiełka.
- Pozostaw roztwór na szkiełku na 1 minutę. Płucz szkiełko przez 1 minutę wodą z kranu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
4. Przygotowanie roztworu amylazy do kontroli negatywnej
- Weź 0,25 g proszku amylazy i rozpuść w 50 ml wody destylowanej. Wlej roztwór do czystej zlewki o pojemności 100 ml.
- Zanurzyć szkiełko w zlewce w taki sposób, aby połowa szkiełka została poddana działaniu środka, a druga połowa pozostała niepoddana działaniu środka, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (rysunek 1C).
- Zanotuj, po której stronie szkiełka podawana jest amylaza. Narysuj linię na odwrocie szkiełka wskazującą granicę między leczeniem a kontrolą.
- Umyj szkiełka preparatem ddH2O, aby usunąć roztwór amylazy i pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.
5. Wykonywanie barwienia i obrazowania metodą Periodic Acid Schiff (PAS)
UWAGA: Odczynniki PAS są toksyczne przez wdychanie i są, więc kroki muszą być wykonane w dygestoriach chemicznych, a produkty przemiany materii muszą być odpowiednio zutylizowane zgodnie z wytycznymi instytucji.
- Umieść szkiełko na płaskiej powierzchni i wlej 1,50-2,00 ml roztworu kwasu okresowego na próbkę. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Opłucz szkiełka w kilku wsadach wody destylowanej.
- Wlać 1,50-2,00 ml odczynnika Schiffa na szkiełko i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
- Umyj szkiełko wodą destylowaną przez 5 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
- Nałożyć 10 μl podłoża montażowego na szkiełko podstawowe i przykryć dwoma małymi szkiełkami nakrywkowymi lub nałożyć 50 μl i użyć jednego dużego szkiełka nakrywkowego.
- Nałóż bezbarwny lakier do paznokci na krawędzie szkiełka nakrywkowego, pozostaw do wyschnięcia na noc.
6. Uzyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopu dwuokularowego przy użyciu obiektywu 100X
