Okresowe barwienie komórek kwasem Schiffa: technika in vitro do wykrywania poziomów glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Izolacja PBMC z krwi pełnej

UWAGA: Przeprowadź tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając sterylnej techniki i sprzętu wysterylizowanego przez producenta.

1. Ostrożnie wlej 10-15 ml krwi pełnej z probówek do pobierania krwi heparynizowanej (antykoagulantowej) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W przypadku drobnych rozlanych wycieków krwi przetrzyj ddH₂O i 70% EtOH za pomocą chusteczki czyszczącej.
2. Rozcieńczyć krew w stożkowej probówce w stosunku 1:1 roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS 1x) o pH 7,4. Upewnij się, że maksymalna całkowita objętość nie przekracza 30 ml.
3. Delikatnie wymieszać za pomocą serologicznego pistoletu do pipet, unikając pęcherzyków powietrza.
   nuta: NIE mieszać przez odwrócenie probówki, aby uniknąć gromadzenia się krwi w nasadce i późniejszego przesiąkania podczas wirowania.
4. Dodać 13 ml Ficoll-paque (patrz tabela materiałów) do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Trzymaj rurkę pionowo w stojaku.
5. Za pomocą pipety transferowej pobrać rozcieńczoną krew, dotknąć końcówki pipety transferowej do wewnętrznej ścianki rurki w pobliżu góry. Z powolnym i stałym ciśnieniem przenieś krew wzdłuż wewnętrznej ścianki rurki, tworząc warstwę krwi na wierzchu warstwy sacharozy. Wykonaj ten krok kilka razy, aż cała krew zostanie przeniesiona.
6. Szczelnie zamknij probówkę i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 700 x g w wirniku obrotowym ze średnim przyspieszeniem ustawionym na 5 i opóźnieniem ustawionym na ZERO.
7. Powoli wyjmij probówkę i nie naruszając warstw, zanieś ją z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
8. Ostrożnie zebrać kożuchową powłokę (cienką, mętną białą warstwę), w której znajdują się PBMC, umieszczoną między warstwami PBS/plazmy i fikolu za pomocą pipety transferowej. Unikaj zbierania warstwy sacharozy i nie naruszaj warstwy czerwonych krwinek.
9. Przenieś kożuchową powłokę do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Może minąć kilka razy powtórzenie kroku 1.8 w celu zebrania wszystkich PBMC.
10. Dodać PBS pH 7,4 do probówki z PBMC i napełnić do oznaczenia 45 ml. Dokładnie wstrząśnij tubką. Nie wirować.
11. Mycie 1: Wirować przez 15 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9. Obserwuj tworzenie się osadu PBMC na dnie stożkowej rurki.
12. Wylać PBS (supernatant) do plastikowej zlewki z 10 ml wybielacza.
13. Poluzuj granulat komórkowy, delikatnie "uderzając" o pofałdowaną powierzchnię (tj. Pusty stojak). Nie wirować.
14. Do probówki dodać 25 ml świeżego PBS o pH 7,4. Jeśli przetwarzana jest więcej niż jedna probówka, na tym etapie połącz pelety.
15. Mycie 2: Wirować probówkę przez 12 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9.
16. Wylać PBS (supernatant) do plastikowej zlewki z odrobiną wybielacza.
17. Delikatnie "stojak" na pofałdowanej powierzchni (tj. pustym stojaku). Nie wirować.
18. Dodać 25 ml świeżego PBS do probówki.
    1. Wyjmij 50 μl komórek i przenieś do probówki mikrowirówkowej w celu zliczenia żywotności.
    2. Dodać równą ilość (50 μl) błękitu trypanowego (barwnik o żywotności) i delikatnie wymieszać, pipetować w górę i w dół.
19. Pobrać 10 μl i przenieść je do hemocytometru, aby sprawdzić żywotność komórek na ml. Zapisać liczbę komórek/ml.
20. Wyjmij żądaną ilość komórek i odwiruj probówkę przez 12 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9.
21. Wylać PBS (supernatant) do zlewki z wybielaczem.
22. Delikatnie "stojak" na pofałdowanej powierzchni (tj. pustym stojaku). Dodać 80 μl PBS do probówki.

2. Tworzenie zjeżdżalni PBMC

1. Umieścić 80 μl komórek na szkiełku mikroskopowym. Rozsmaruj kroplę za pomocą innego szkiełka lub umieść 2 krople po 40 μl każda na obu końcach szkiełka.
2. Pozostaw szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia. Oznacz szkiełko ołówkiem po matowej stronie.

3. Utrwalanie próbek na slajdach

1. Przygotować roztwór utrwalający, mieszając 0,5 ml 37% formaldehydu z 4,5 ml 99% etanolu.
2. Po wysuszeniu szkiełek należy wyjąć 2 ml świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego i wylać go na szkiełko tak, aby pokryć całą powierzchnię szkiełka.
3. Pozostaw roztwór na szkiełku na 1 minutę. Płucz szkiełko przez 1 minutę wodą z kranu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

4. Przygotowanie roztworu amylazy do kontroli negatywnej

1. Weź 0,25 g proszku amylazy i rozpuść w 50 ml wody destylowanej. Wlej roztwór do czystej zlewki o pojemności 100 ml.
2. Zanurzyć szkiełko w zlewce w taki sposób, aby połowa szkiełka została poddana działaniu środka, a druga połowa pozostała niepoddana działaniu środka, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (rysunek 1C).
3. Zanotuj, po której stronie szkiełka podawana jest amylaza. Narysuj linię na odwrocie szkiełka wskazującą granicę między leczeniem a kontrolą.
4. Umyj szkiełka preparatem ddH₂O, aby usunąć roztwór amylazy i pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.

5. Wykonywanie barwienia i obrazowania metodą Periodic Acid Schiff (PAS)

UWAGA: Odczynniki PAS są toksyczne przez wdychanie i są, więc kroki muszą być wykonane w dygestoriach chemicznych, a produkty przemiany materii muszą być odpowiednio zutylizowane zgodnie z wytycznymi instytucji.

1. Umieść szkiełko na płaskiej powierzchni i wlej 1,50-2,00 ml roztworu kwasu okresowego na próbkę. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Opłucz szkiełka w kilku wsadach wody destylowanej.
3. Wlać 1,50-2,00 ml odczynnika Schiffa na szkiełko i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
4. Umyj szkiełko wodą destylowaną przez 5 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
5. Nałożyć 10 μl podłoża montażowego na szkiełko podstawowe i przykryć dwoma małymi szkiełkami nakrywkowymi lub nałożyć 50 μl i użyć jednego dużego szkiełka nakrywkowego.
6. Nałóż bezbarwny lakier do paznokci na krawędzie szkiełka nakrywkowego, pozostaw do wyschnięcia na noc.

6. Uzyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopu dwuokularowego przy użyciu obiektywu 100X

Rycina 1: Metodologia barwienia PAS krok po kroku na PBMC.(A) Po pierwsze, izolację PBMC uzyskuje się za pomocą gradientu fikolu, lewy panel pokazuje przygotowanie przed wirowaniem, prawy panel pokazuje go po odwirowaniu, gdzie w środku probówki obserwuje się kożuchową powłokę zawierającą PBMC. (B) Izolowane PBMC mocuje się na szkiełku za pomocą roztworu utrwalającego formalina i etanol. Szkiełko delikatnie spłukuje się wodą destylowaną z plastikowej butelki do mycia. (C) Szkiełko umieszcza się następnie w zlewce o pojemności 100 ml wypełnionej do połowy roztworem amylazy, który rozpuści glikogen. Szkiełko jest delikatnie spłukiwane. (D) Szkiełko poddaje się działaniu roztworu kwasu okresowego, w którym zachodzi utlenianie sacharydów. Szkiełka są delikatnie spłukiwane; Spowoduje to usunięcie nadmiaru kwasu okresowego i zatrzymanie etapu utleniania. (E) Gdy odczynnik Schiffa zostanie dodany do szkiełek, będzie on reagował z aldehydami powstałymi na etapie utleniania. Ten bezbarwny odczynnik spowoduje powstanie produktu w kolorze ciemnoczerwonym w kolorze magenta. Szkiełka są delikatnie płukane w celu usunięcia nadmiaru odczynnika Schiffa.