Barwienie skrawków tkanek fioletem krezylowym: procedura barwienia mająca na celu uwidocznienie chrząstki i kości w zamrożonych skrawkach zarodków myszy

Streszczenie

Źródło: Wu, Meng, et al., Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki i kości embrionalnej myszy do analizy ekspresji genów. J. Vis. Exp.(2019 rok)

Ten film opisuje procedurę barwienia fioletem krezylowym w celu wizualizacji kości i chrząstek w sekcjach koronalnych zamrożonych embrionów myszy. Ta technika barwienia pomaga odróżnić kości i chrząstki o wyraźnych kolorach od otaczających tkanek.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie próbki do mikrodysekcji laserowej

1. Przygotuj roztwory do barwienia i odwadniania.
   1. Umieść 45 ml 80% etanolu w każdej z trzech probówek wirówkowych o pojemności 50 ml na lodzie. Oznacz je jako #1, #2 i #3. Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz/DNaz.
   2. Umieść 45 ml 95% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.
   3. Umieść 45 ml 100% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.
   4. Umieść 45 ml ksylenu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Ksylen powinien być używany w dygestorium.
2. Rozmrozić na krótko szkiełko z membraną PEN, przykładając je do dłoni w rękawiczce, a następnie umyć dwukrotnie przez 30 sekund w 45 ml 80% etanolu (#1 i #2) z mieszaniem w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml w celu usunięcia OCT.
   UWAGA: Ważne jest, aby usunąć OCT przed barwieniem, aby zapobiec zasłanianiu sekcji przez OCT poluzowany podczas barwienia. Kleszcze mogą być używane w celu ułatwienia usuwania OCT, który nie jest zmywany przez mieszanie.
3. Połóż szkiełko na arkuszu folii aluminiowej. Odpipetować 0,8 ml 0,1% fioletu krezylowego w 50% etanolu na szkiełko i barwić przez 30 s. Myć szkiełko w 45 ml 80% etanolu (#3) przez 30 s, a następnie odwadniać przez przejście przez 30 s przez 45 ml 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenu w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.
4. Stojak przesuwa się na delikatnej wycieraczce roboczej przez 5 minut, aby opróżnić ksylen i suche sekcje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka wirówkowa	ThermoFisher Naukowy	339653	Stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu, 50 ml
Octan fioletu krezylowego	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C5042
Delikatna wycieraczka zadaniowa	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 06-666
woda destylowana	Invitrogen	Numer katalogowy: 10977-015	Bez DNaz/RNaz
Etanol absolutny (200 proof)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał BP2818	Klasa biologii molekularnej
Szklana prowadnica membranowa PEN	Mikrosystemy Leica	11505158
Związek OCT	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy: 102094-106
Środek do odkażania RNazy	Sigma-Aldrich	Czynnik chłodniczy 2020	Środek odkażający RNaza do czyszczenia powierzchni
ksylen	Sigma-Aldrich	214736