$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie żelu
- Wykonaj SDS-PAGE z 4% - 12% żelami białkowymi Bis-Tris (1 mm, 15-dołkowymi) przy użyciu mini zbiornika żelowego wypełnionego buforem kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES).
- Rozcieńczyć próbki mieszaniną wody destylowanej, buforu dodecylosiarczanu litu (LDS) i środka redukującego próbkę.
- Załaduj pierwszą linię podwójną ilością bulionu (10 μl), a następnie normalną ilością bulionu (5 μl), a następnie serią dwukrotnych rozcieńczeń wywaru (13 rozcieńczeń, od 2x do 8192x).
- Uruchom żel przy stałym napięciu 200 V przez 30 minut.
2. Utrwalenie żelu
- Po elektroforezie zanurzyć żele w 100 ml roztworu 40% etanolu/10% kwasu octowego na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej 2x (każdy przez 30 min) lub na noc w temperaturze 4 °C.
- Umyj żele po 3 x 10 min w ultraczystej wodzie w czystym pojemniku. Etap mycia ma kluczowe znaczenie. Jeśli kwas z roztworu utrwalającego nie zostanie prawidłowo usunięty na etapie wywoływania fluorogenicznego, nadmiar TPE-4TA zostanie aktywowany przez kwas i doprowadzi do silnej fluorescencji tła w żelu.
3. Przygotowanie roztworu AgNO3 i impregnacja żelu srebrem
- Aby przygotować roztwór AgNO3 (0,0001%) do impregnacji, najpierw rozpuść 0,01 g AgNO3 w 10 ml ultraczystej wody, aby przygotować 0,1% roztwór podstawowy AgNO3. Następnie dodaj 100 μl 0,1% roztworu podstawowego AgNO3 do 100 ml ultraczystej wody, aby uzyskać roztwór roboczy.
nuta: Roztwór AgNO3 należy przechowywać w ciemności przed użyciem.
- Zaimpregnować żel 100 ml roztworu roboczego srebra przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w szczelnie zamkniętym szklanym pojemniku. Bardzo ważne jest, aby impregnację srebrem wykonywać pod wyciągiem, zabezpieczonym przed światłem folią aluminiową.
- Umyj żel ultraczystą wodą (około 100 ml) w czystym pojemniku przez 2 x 60 s.
4. Fluorogenny rozwój żelu
- Aby przygotować roztwór podstawowy barwnika (0,1 mM), dodaj 3,0 mg barwnika TPE-4TA w 50 ml ultraczystej wody. Sonikować roztwór przez kilka minut i dodać trochę roztworu NaOH (na przykład 1 M), aby pomóc rozpuścić barwnik.
- Sprawdź fluorescencję roztworu pod lampą UV 365 nm, aby upewnić się, że cząsteczka barwnika jest całkowicie rozpuszczona. Tylko roztwory słabe lub nieemisyjne wskazują na całkowite rozpuszczenie.
nuta: Barwnik TPE-4TA został zsyntetyzowany zgodnie z protokołem niedawno opisanym przez Xie i wsp.Roztwór TPE-4TA jest bardzo stabilny i może być przechowywany w ciemności przez wiele miesięcy.
- Aby przygotować 100 ml fluorogenicznego roztworu rozwijającego (10 μM), dodaj 10 ml roztworu podstawowego TPE-4TA do 90 ml ultraczystej wody. Sprawdzić pH roztworu za pomocą pH-metru i dostroić je do 7-9 za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (1 μM).
- Przenieść żel do czystego i zamykanego pojemnika ze 100 ml fluorogenicznego roztworu rozwijającego. Upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony w roztworze. Zamknij pojemnik. Przykryj go przed światłem i potrząśnij przez noc na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, etap inkubacji można również skrócić do około ~2 godzin, podgrzewając roztwór do wywoływania AIE do 80 °C w celu barwienia, a następnie pozostawiając go w temperaturze pokojowej.
5. Odbarwienie i obrazowanie
- Przenieść żel do czystego pojemnika i odbarwić go w 100 ml 10% etanolu przez 30 min.
nuta: Do mycia żelu można użyć samej wody. Jednak bardziej efektywne czasowo jest użycie 10% roztworu etanolu do odbarwiania. Pomoże to skrócić proces odbarwiania z godzin do 30 minut.
- Płucz żel w ultraczystej wodzie przez 5 minut.
- Zobrazuj żel w kanale 365 nm lub kanale 302 nm za pomocą maszyny do dokumentacji żelu.