Barwienie kropelkami lipidów larw Drosophila oenocytes: technika oceny akumulacji kropelek lipidów w warunkach normalnych i stresowych przy użyciu barwnika na bazie BODIPY

Streszczenie

Źródło: Wei, C., et al., Dyssekcja i barwienie kroplkami lipidów w oenocytach u larw Drosophila. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje barwienie kropelkami lipidów w enocytach larwalnych Drosophila - komórkach podobnych do hepatocytów - przy użyciu lipofilowego barwnika fluorescencyjnego na bazie BODPY. Komórki te działają jako model do badania metabolizmu lipidów podczas rozwoju i w odpowiedzi na stres środowiskowy, taki jak głód.

Protokół

1. Leczenie głodu dla larw

UWAGA: U larw trzeciego stadium rozwojowego, w enocytach jest niewiele lub nie ma ich wcale wykrywalnych kropelek lipidów w normalnych warunkach żywienia, ale liczne duże kropelki lipidów mogą być indukowane w enocytach w warunkach stresu, takich jak głód. Aby dokładniej zweryfikować tę metodę, konieczne jest wstępne poddanie tych larw obróbce w celu wywołania biogenezy kropelek lipidów w enocytach. Tutaj jako paradygmat wybrano przebieg głodu wynoszący 12 godzin, 24 godziny i 36 godzin. W szczególności krótki okres głodu (np. 3 godziny) jest wystarczający do wywołania wykrywalnych kropelek lipidów w enocytach. Czas głodu może się różnić w zależności od konkretnych celów i ustawień eksperymentalnych.

1. Zrób komory do głodzenia i zabiegów kontrolnych.
   1. W przypadku komór do leczenia głodowego: umieścić bibułę filtracyjną o odpowiednim rozmiarze na szalce Petriego o średnicy 6 cm i odpipetować 1 ml PBS na bibułę filtracyjną.
   2. W przypadku komór kontrolnych do zabiegów: umieść 5 ml standardowego pokarmu z mąki kukurydzianej Bloomington na szalce Petriego.
2. Za pomocą szpatułki delikatnie wykop górną warstwę pokarmu zawierającego larwy, które nadal zagrzebują się w pożywieniu i przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną 5 ml PBS. Delikatnie wymieszaj larwy w PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pokarmowe z larw i uczynić je tak czystymi, jak to tylko możliwe.
3. Użyj małego pędzla, aby zebrać 40 larw trzeciego stadium rozwojowego o tej samej przybliżonej wielkości. Posortuj je losowo do komory głodowej lub kontrolnej, z 20 larwami każda.
4. Umieścić komory w inkubatorze w temperaturze 25 °C przy wilgotności 60% i pozostawić na rozwój przez 12 godzin, 24 godziny i 36 godzin leczenia.
   UWAGA: W przypadku larw w komorze głodowej dodawać 1 ml PBS co 12 godzin, aby uniknąć odwodnienia larw.

2. Sekcja enocytów

1. Użyj małego pędzla, aby wybrać larwy w odpowiednim wieku (12 godzin, 24 godziny lub 36 godzin po zabiegu), a następnie przenieś je na nową szalkę Petriego wypełnioną 5 ml lodowatego PBS do umycia.
   UWAGA: Powtórz krok 2.2 w przypadku larw w komorze kontrolnej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia żywności.
2. Napełnij płytkę preparacyjną lodowatym PBS i za pomocą kleszczy delikatnie przenieś larwy na płytkę preparacyjną. Umieść płytkę separacyjną pod mikroskopem stereoskopowym w celu wykonania następującego etapu sekcji.
   UWAGA: Lodowata temperatura pomoże spowolnić ruchy larw i ułatwi preparację.
3. Obróć larwy brzuszną stroną do góry i grzbietową do dołu i delikatnie przytrzymaj w miejscu za pomocą kleszczy. Przymocuj larwy do płytki preparcyjnej, umieszczając szpilkę do wypreparowania przez gardło na przednim końcu, a drugą szpilkę przez przetchlinkę na tylnym końcu.
   UWAGA: Stronę grzbietową najłatwiej rozpoznać po obecności pni grzbietowych tchawicy.
4. Użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby naciąć (wzdłużnie) naskórek od przodu do tylnego końca.
5. Usuń wewnętrzną tkankę naskórka za pomocą kleszczy.
   UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas usuwania gałęzi tchawicy, aby uniknąć uszkodzenia enocytów, które są zlokalizowane na wewnętrznej powierzchni naskórka.
6. Za pomocą kleszczy wyjmij szpilki preparacyjne i przenieś naskórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej PBS na lodzie.
7. Kontynuuj sekcję innych larw zgodnie z procedurą opisaną powyżej.

3. Barwienie kropelkami lipidów

1. Inkubuj wypreparowany naskórek w buforze utrwalającym przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze.
   nuta: Bufor utrwalający zawiera 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS.
2. Usuń bufor utrwalający, a następnie szybko umyj. Aby przeprowadzić szybkie płukanie, dodaj 1 ml PBS w temperaturze pokojowej do probówki po usunięciu PFA, delikatnie zawieś ponownie chusteczki i wyrzuć PBS.
   ostrożność: Bufor utrwalający zawiera PFA, który jest szkodliwy dla zdrowia ludzkiego. Ważne jest, aby prawidłowo zutylizować bufor utrwalający jako odpad niebezpieczny.
3. Przemyć próbki 3 razy przez 5 minut każda za pomocą PBS, aby wypłukać wszystkie możliwe pozostałości PFA.
4. Inkubować naskórek za pomocą BODIPY 493/503 (1 μg/ml; patrz tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.
   nuta: Począwszy od tego etapu, owiń probówkę mikrowirówki kawałkiem folii aluminiowej, aby chronić próbki przed światłem i zminimalizować możliwe fotowybielanie.
5. Usunąć roztwór barwiący BODIPY 493/503 i przemyć próbki 3x przez 10 minut każda za pomocą PBS, aby całkowicie usunąć resztki barwników.

4. Montaż i obrazowanie

1. Umieścić 6 μl podłoża montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym.
   nuta: Medium montażowe służy do wydłużenia czasu wykrywania ze względu na jego właściwości zapobiegające blaknięciu.
2. Użyj kleszczyków, aby podnieść jeden naskórek i delikatnie usuń resztki PBS za pomocą chusteczki.
3. Umieść naskórek w podłożu montażowym i dostosuj jego orientację tak, aby jego wewnętrzna powierzchnia zawierająca enocyty znajdowała się na dole, a jego zewnętrzna powierzchnia znajdowała się na górze.
4. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na naskórek.
   nuta: W razie potrzeby usunąć nadmiar materiału montażowego wyciekającego spod szkiełka nakrywkowego za pomocą ściereczki. Aby ułatwić obrazowanie, delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe kleszkami, aby podczas obserwacji szkiełka przez mikroskop można było łatwo zobrazować klaster enocytów w jednej płaszczyźnie. Alternatywnie możliwe jest przecięcie naskórka na dwie półnaskórki przez środkową linię, aby uniknąć zwijania się całego naskórka podczas montowania tkanek.
5. Nałóż bezbarwny lakier do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić.
6. Umieść szkiełka w światłoodpornym pudełku na próbki i pozwól lakierowi do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, co może zająć 5-10 minut.
7. Kontynuuj analizę mikroskopową. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego (powiększenie 63x ze zoptymalizowanymi ustawieniami filtra GFP lub FITC, wzbudzenie = 488 nm, emisja = 503 nm), aby uzyskać czyste i czułe sygnały o zminimalizowanym tle.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka wirówkowa 50 ml	Corning	430829	50 ml
Szalka Petriego 6 cm	Rybak termiczny	150326	6 cm
agar			Na pokarm dla much
Folia aluminiowa	N/a	N/a	Chroń plamę przed światłem
BODIPY 493/503	Invitrogen	Zobacz materiał D3922	Barwnik barwiący kropelkami lipidów
Mikroskop konfokalny	Księga Leica	Leica TSC SP5	Obrazowanie konfokalne
Syrop kukurydziany			Na pokarm dla much
Kukurydziana			Na pokarm dla much
Szkiełko nakrywkowe	Citoglas powiedział:	10212424C	20 × 20 mm, grubość 0,13-0,17
Szpilka preparcyjna	N/a	N/a
Płyta sekcyjna	N/a	N/a
Bibuła filtracyjna	N/a	N/a	Średnica: 11 cm
Bufor utrwalający	N/a	N/a	4% paraformaldehydu (PFA) w 1x Pbs
Kleszcz	Dumont	Numer katalogowy: 11252-30	#5
inkubator	Jiangnan	SPX-380 (wersja angielska)	Do hodowli much
Probówka do mikrowirówek	Axygen (Axigen	MCT-150-C	1,5 ml
Szkiełko mikroskopowe	Citoglas powiedział:	10127105P-G
Medium montażowe	VECTASHIELDAntifade Montaż Średni	H-1000	Środek montażowy zapobiegający blaknięciu
lakier do paznokci	PanEra	AAPR419	Uszczelnij szkiełko nakrywkowe
pędzel	N/a	N/a
Pbs	N/a	N/a	1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na_{2} HPO_{4} ,1,8 mM KH_{2} PO_{4} , pH 7,4)
Rotator	Instrumenty laboratoryjne Kylin-Bell	WH-986
Nożyczek	Smartdata Medycyna	Zobacz materiał SR81	Nożyczki sprężynowe Vannas
Mąka sojowa			Na pokarm dla much
łopatka	N/a	N/a
Standardowe jedzenie z mąki kukurydzianej	N/a	N/a	Zgodnie z Bloomington standard Przepis na jedzenie z mąki kukurydzianej
Mikroskop stereoskopowy	Księga Leica	Leica S6E	Do rozwarstwiania tkanek
Wytrzyj papier	N/a	N/a
drożdże			Na pokarm dla much

powiedział: )