$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Roztwór do barwienia LCO
UWAGA: Jeśli hFTAA jest kupowana od komercyjnego dostawcy, należy postępować zgodnie z instrukcjami dostawcy zamiast z sekcją 1.
- Zawiesić liofilizowany hFTAA w 2 mM NaOH, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml. Przechowywać bulion w szklanej fiolce w temperaturze 4 °C. Zapasy mogą być przechowywane przez jeden rok.
- W dniu barwienia przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając bulion w stosunku 1:10 000 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
2. Przygotowanie próbek tkanek
UWAGA: Wiele typów tkanek można obrazować przy użyciu hFTAA jako markera amyloidu. Przykłady przedstawiono na rysunku 1. hFTAA jest wrażliwy na konformację agregatów. W związku z tym barwienie powinno być najlepiej przeprowadzane na nienaruszonych kruszywach bez ekspozycji epitopów. Optymalna jakość widmowa jest osiągana, jeśli utrwalenie tkanki jest ograniczone do minimum. Dlatego preferowany jest świeżo zamrożony materiał, delikatnie utrwalony w etanolu w czasie barwienia. Możliwe jest jednak wykrycie złogów amyloidu również w tkance, która została utrwalona np. formaliną. hFTAA na ogół dobrze przenika do tkanki. Wybierz grubość próbki, która jest zgodna z zamierzoną techniką obrazowania.
- Jeśli stosuje się skrawki utrwalone formaliną, zatopione w parafinie, odparafinowane w ksylenie przez noc. Zanurz sekcje w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu,dH2Oi PBS, po 10 minut w każdej. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w warunkach otoczenia. Uwaga: Ksylen jest zawsze przenoszony w dygestorium chemicznym. Ksylen i inne rozpuszczalniki organiczne są szkodliwe.
- Rozmrozić kriosekcje w temperaturze pokojowej. Utrwal skrawki tkanek w 10% formalinie przez noc i nawodnij, zanurzając je w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu,dH2Oi PBS, po 10 minut w każdej. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w warunkach otoczenia.
- Dodać kropelki roztworu roboczego hFTAA (około 200 μl) do skrawków tkanki, aby ją przykryć. Kropla powinna pozostać na miejscu dzięki napięciu powierzchniowemu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu barwienia.
- Spłukać roztwór barwiący 500 μl PBS za pomocą pipety, a następnie zanurzyć szkiełko w kąpieli PBS na 10 minut. Pozostawić sekcję do wyschnięcia w warunkach otoczenia.
- Zamontuj za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Odczekać, aż podłoże montażowe osiada przez noc.
UWAGA: barwienie hFTAA można przeprowadzić w połączeniu z innymi metodami barwienia, takimi jak immunofluorescencja, markery specyficzne dla komórek lub organelli itp. Aby przeprowadzić współbarwienie, uruchom kompletny wybrany protokół barwienia i dodaj barwienie hFTAA na końcu, zaczynając od kroku 2.2. Przykłady przedstawiono na rysunku 2. W przypadku immunofluorescencji najlepiej wybrać przeciwciało drugorzędowe, które jest wzbudzone przy długości fali 640 nm lub wyższej. W tym zakresie długości fal hFTAA nie absorbuje, a zatem nie może być wzbudzony i nie ulega fluorescencji. Gwarantuje to, że nie widać krwawienia między hFTAA a przeciwciałem.
