Barwienie TTC wycinków tkanki mózgowej szczura: procedura barwienia mająca na celu rozróżnienie żywotnej i martwiczej tkanki w wycinkach tkanek po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym

Streszczenie

Źródło: Liepinsh, E., et al. Przygotowanie serca i tkanki mózgowej gryzoni do cyfrowej makrofotografii po niedokrwieniu-reperfuzji. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film opisuje procedurę barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylo-2H-tetrazolu w celu wizualizacji wycinków tkanki mózgowej szczura i rozróżnienia żywotnych i uszkodzonych tkanek po zamknięciu i reperfuzji tętnicy środkowej mózgu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Barwienie i krojenie mózgu

1. Po eksperymencie z niedrożnością tętnicy środkowej mózgu usuń mózg, w tym pień mózgu, z czaszki i umyj go w lodowatym PBS.
2. Wybierz odpowiedni rozmiar matrycy mózgu ze stali nierdzewnej (patrz tabela materiałów) w zależności od wagi zwierząt (rysunek 1B). Umieść mózg brzuszną stroną do góry w macierzy mózgowej.
   nuta: Po umieszczeniu w matrycy brzuszna powierzchnia mózgu musi być równoległa do górnej powierzchni formy.
3. Za pomocą ostrzy ogranicz przednią i ogonową część mózgu (po 2 ostrza z obu stron).
   nuta: Należy używać żyletek kompatybilnych z matrycą do krojenia. Ogólnie rzecz biorąc, do krojenia mózgów szczurów można użyć kompatybilnej, jednokrawędziowej żyletki (o grubości do 0,01 cala (0,254 mm)).
4. Włóż ostrza częściowo (nie do końca przecinając mózg) w kanały między pierwszym a ostatnim ostrzami. Kiedy wszystkie ostrza zostaną włożone i ułożone równolegle, dociśnij wszystkie ostrza dłonią w tym samym czasie, aby pokroić mózg na 2 mm plastry koronalne.
5. Chwyć mocno ostrza wzdłuż boków dwoma palcami i wyjmij je razem z pokrojonym mózgiem z matrycy.
6. Ułóż plastry mózgu jeden po drugim na tacy (70 ml, 72 x 72 mm). Podczas układania plastrów upewnij się, że przednia powierzchnia każdego plasterka jest zawsze skierowana do góry.
7. Wlać ciepły (+37 °C) 1% roztwór TTC w PBS na plastry mózgu i inkubować je przez 8 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
   nuta: Wycinki mózgu muszą być całkowicie zanurzone w roztworze TTC podczas inkubacji.
8. Po inkubacji w 1% roztworze TTC przenieś wycinki mózgu na niebieską plastikową tacę, aby uchwycić obrazy. Ułóż plastry mózgu w kolejności sekwencyjnej od części czołowej do ogonowej i użyj skalpela, aby oddzielić półkule w płaszczyźnie strzałkowej.

Wyniki

Rycina 1: Macierze do krojenia serca i mózgu szczura. (A) Serce szczura, (B) mózg szczura.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)	Sigma-Aldrich	298-96-4
Matryca krajalnicy mózgu dorosłego szczura	Instrumenty Zivic	BSRAS001-1
Żyletki z pojedynczą krawędzią	Instrumenty Zivic	BLADE012.1
Bezlusterkowy aparat cyfrowy Sony Alpha a6000	Sony	ILCE6000	Może być odtworzony za pomocą dowolnej nowoczesnej kamery cyfrowej
Ostrze chirurgiczne	Heinz Herenz, Hamburg, Niemcy	Zobacz materiał BS2982
Tacka wagowa, 70 ml	Sarsted (Wyspa Sarsted	71,99,23,212
Wytrząsarka termiczna	Kompleks BioSan	PST-60HL-4
Kleszczyki do tkanek zębatych	Agnthos powiedział:	Numer katalogowy 11021-12
chlorek sodu	Odczynniki Fishera	Zobacz materiał BP358-10
Kleszczyki szklane nakrywkowe, kątowe	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11073-10