Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian: technika in vitro do wykrywania hodowanych osteoklastów zawierających enzym TRAP

Streszczenie

Źródło: Dai, Q., et al. Test hodowli osteoklastów myszy oparty na Ten film demonstruje technikę barwienia kwasową fosfatazą odporną na winian w celu wykrycia obecności granulek zawierających TRAP wewnątrz osteoklastów. Technika ta tworzy purpurowe osady granulek barwnika w cytoplazmie osteoklastów, czyniąc je widocznymi pod odwróconym mikroskopem.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie

1. Wygeneruj myszy z delecją specyficzną dla osteoklastów Raptor (Raptor^{fl / fl}; Ctsk-cre, dalej Rap^Ctsk) przez kojarzenie myszy ^{Raptor fl/fl} z myszami Ctsk-cre. Użyj myszy ^{Raptor fl / fl} jako kontroli WT w tym badaniu.
2. Miej pojemnik z lodem, aby utrzymać odizolowaną kość.
3. Przygotuj pożywkę hodowlaną.
   1. Przygotuj pożywkę hodowlaną α-MEM, uzupełniając minimalną niezbędną pożywkę alfa (α-MEM) 1x glutaminą, penicyliną-streptomycyną i 10% płodową surowicą cielęcą.
   2. Przygotować pożywkę do indukcji makrofagów szpiku kostnego składającą się z 50 ml pożywki α-MEM i M-CSF w stężeniu 20 ng/ml.
   3. Przygotować pożywkę do indukcji osteoklastów składającą się z M-CSF i RANKL odpowiednio w stężeniu 20 ng/ml w 50 ml pożywki α-MEM.
4. Przygotuj następujące przed barwieniem TRAP.
   1. Przygotować roztwór utrwalający składający się z 6,5 ml acetonu, 2,5 ml roztworu cytrynianu i 0,8 ml 37% (obj./obj.) roztworu formaldehydu.
   2. Przygotuj roztwór do barwienia TRAP.
      1. Podgrzej wodę dejonizowaną do temperatury 37 °C.
      2. Dodaj 100 μl roztworu bazowego GBC szybkiego granatu i 100 μl roztworu azotynu sodu do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i mieszaj przez delikatną inwersję przez 30 s. Pozostaw mieszaninę na 2 minuty.
      3. Podgrzej 9 ml wody dejonizowanej do temperatury 37 °C. Dodać 200 μl roztworu zasadowego GBC diazotowanego granatu szybkiego z kroku 1.4.2.2, 100 μl roztworu fosforanu AS-BI naftolu, 400 μl roztworu octanu i 200 μl roztworu winianu.
      4. Roztwór mieszaniny barwiącej TRAP należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.

2. Sekcja (Dzień-1)

1. Poddaj eutanazji 3 miesięczne samice myszy WT i Rap^Ctsk osobno za pomocą CO₂. Wdychanie CO₂ należy wykonywać przy użyciu odpowiedniego sprzętu przez przeszkolony personel.
2. Zanurz 6 myszy w zlewce ze 100 ml 75% etanolu (obj./obj.) na 5 minut, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, a następnie umieść na desce sekcyjnej w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie w dystalnej części kości piszczelowej pionowo i wypreparuj skórę wzdłuż tylnej kończyny nożyczkami okulistycznymi.
3. Przetnij więzadło stawowe stawu biodrowego nożyczkami i zwichnij tylne kończyny od tułowia.
4. Przetnij więzadło stawowe stawu kolanowego i ostrożnie odłącz kość piszczelową i udową od stawu kolanowego. Delikatnie usuń miękką tkankę nożyczkami.
5. Umieść wszystkie kości jednego genotypu jednej myszy w każdym dołku sześciodołkowej płytki z 2 ml α-MEM na lodzie.
   nuta: Aby zachować żywotność komórek, kość powinna być przechowywana w tych warunkach krócej niż 1 godzina.

3. Izolacja (Dzień-1)

1. Napełnij jedną studzienkę sześciodołkowej płytki 75% etanolem (3 ml), a pozostałe 5 dołków pożywką α-MEM (3 ml).
2. Umieścić wszystkie kości jednego genotypu w płuczce etanolowej na 15 s i za każdym razem myć kości 5 razy pożywką α-MEM przez 10 s.
3. Odetnij nasady nożyczkami i włóż igłę strzykawkową 0,45 mm do jamy kostnej i wypłucz szpik z pożywką α-MEM do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
4. Przepłucz jamę kostną tą samą metodą z drugiego końca kości. Powtórz co najmniej dwa razy, aby dokładnie umyć jamę kostną, aż kość będzie blada.
5. Odwirować szpik kostny w celu uzyskania osadu komórkowego o temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
6. Dodać 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek do probówki wirówkowej i delikatnie odpipetować, aby ponownie zawiesić szpik kostny. Trzymaj probówkę wirówkową na lodzie przez 8 minut, aby zrazić czerwone krwinki.
7. Dodaj 6 ml pożywki α-MEM do probówki wirówkowej, aby zatrzymać lizę komórek. Wirować w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i zasysać supernatant.
8. Zawiesić ponownie w 3 ml pożywki hodowlanej α-MEM i umieścić komórki na płytce sześciodołkowej (zwykle jedna mysz na studzienkę).
9. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 przez} noc.

4. Poszycie (Dzień 0)

1. Przenieść supernatant do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu zebrania nieprzyłączonych komórek następnego ranka.
2. Wirować w temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatant.
3. Zawiesić w 4 ml pożywki hodowlanej α-MEM.
4. Weź 20 μl roztworu komórkowego i wymieszaj z 20 μl błękitu trypanowego. Dodać 10 μl mieszaniny do komory liczenia i uzyskać liczbę komórek na ml roztworu.
5. Dodać odpowiednią objętość pożywki hodowlanej α-MEM, aby uzyskać roztwór komórkowy o objętości 500 000 komórek/ml.
6. Dodać 500 μl i 50 μl pożywki indukcyjnej makrofagów szpiku kostnego do każdego dołka odpowiednio płytki 24-dołkowej i 96-dołkowej.
7. Dodać 500 μl i 50 μl roztworu komórkowego do każdego dołka odpowiednio na płytce 24-dołkowej i 96-dołkowej.
8. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 przez} 3 dni.

5. Zróżnicowanie (dni 3-7)

1. Trzy dni po posiewie zebrać 50 μl pożywki z każdego dołka płytki 96-dołkowej i zamrozić w temperaturze -20 °C, a następnie odessać pozostałą pożywkę.
2. Dodać 1 ml i 100 μl pożywki do indukcji osteoklastów do każdego dołka odpowiednio płytki 24-dołkowej i płytki 96-dołkowej.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 dni.
4. Zebrać 50 μl pożywki z każdej studzienki i odessać pozostałą pożywkę.
5. Dodaj pożywkę do indukcji osteoklastów do każdej studzienki.
6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 dzień.
   nuta: W tym momencie duże, wielojądrzaste osteoklasty powinny być widoczne pod odwróconym mikroskopem (ryc. 1A).
7. Jeśli osteoklasty nie są widoczne, należy zmienić pożywkę do indukcji osteoklastów i obserwować codziennie, aż osteoklasty będą widoczne.
8. Zebrać 50 μl pożywki z każdej studzienki 96-dołkowej płytki po utworzeniu osteoklastów.

6. Barwienie kwasową fosfatazą odporną na winian (TRAP)

UWAGA: Dojrzałe osteoklasty mogą być obecne po 6-7 dniach hodowli in vitro (krok 4).

1. Odessać podłoże i delikatnie przemyć 3 razy 1x PBS.
2. Umieścić komórki w każdym dołku płytki 96-dołkowej za pomocą 100 μl roztworu utrwalającego przez 30 s w temperaturze pokojowej.
3. Po utrwaleniu odessać roztwór utrwalający i delikatnie przemyć 3 razy wodą dejonizowaną podgrzaną do 37 °C. Odsysać wodę dejonizowaną.
4. Dodać 100 μl barwnika TRAP do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, osłaniając przed światłem.
5. Po zabarwieniu odessać plamę TRAP i delikatnie zmyć 3 razy wodą dejonizowaną.
6. Obraz osteoklastów za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu.

Wyniki

Rycina 1: Reprezentatywny widok osteoklastów.(A) Gigantyczne osteoklasty zaobserwowane w jasnym polu w dniu 6. Czerwona linia wyznaczała granicę osteoklastów. (B) Typowo gigantyczny, wielojądrowy, TRAP-dodatni (winnoczerwony) osteoklast. strzałka wskazywała dwa jądra wielojądrowego osteoklastu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy Raptorfl/fl	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy: 13188
Myszy Ctsk-cre			prezent od S. Kato, Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia
α-MEM	Corning	10-022-CVR
glutamina	Gibico (powiat Gibico	25030081
Penicylina streptomycyna	Gibico (powiat Gibico	15140122
Surowica cielęca płodu	BioInd	04-001-1A
Rekombinowane mysie białko M-CSF	Prace badawczo-rozwojowe	Q3U4F9
Rekombinowane mysie białko RANKL	Prace badawczo-rozwojowe	Q3TWY5
Bufor do lizy RBC	Beyotime	Zobacz materiał C3702
Trypan niebieski	Sigma-Aldrich	302643
aceton	Shanghai Chemical Co., Sp. z o.o.
Roztwór cytrynianu	Sigma-Aldrich	Z numerem 915
Roztwór formaldehydu	Shanghai Chemical Co., Sp. z o.o.
Zestaw fosfatazy kwaśnej, leukocytów (TRAP)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał 387A-1KT
Szybki roztwór bazowy GBC	Sigma-Aldrich	3872
Roztwór azotynu sodu	Sigma-Aldrich	Z numeru 914
Roztwór fosforanu naftolu AS-BI	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 3871
Roztwór octanu	Sigma-Aldrich	3863
Roztwór winianu	Sigma-Aldrich	3873
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco	Corning	21-031-CVR
37% formaldehydu	Xilong naukowy
Zobacz materiał IX71	Olympus
Strzykawka 0,45 mm
Nożyczek
Kleszcz komarów

) ) powiedział: powiedział: granatu SZT. TGL TGL TGL