Barwienie czerwienią alizaryny: technika wizualizacji mineralizacji przez hodowane osteoblasty

Streszczenie

Źródło: Kampleitner, C., et al. Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę barwienia do wykrywania stopnia mineralizacji lub depozycji wapnia w hodowanych pierwotnych osteoblastach za pomocą barwnika Alizarin Red.

Protokół

1. Mineralizacja osteoblastów (OB) oceniana przez barwienie czerwienią Alizarin Red S (ARS)

1. Dodaj pierwotne osteoblasty (OB) do krążków fosforanu β-triwapniowego (β-TCP) używanych jako biokompatybilne rusztowanie na płytce hodowlanej.
2. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków zawierających pierwotne OB 14 dni po dodaniu pożywki mineralizacyjnej i przepłukać dwukrotnie 0,5 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej. Odessać PBS i utrwalić komórki, dodając 0,5 ml 10% buforowanego roztworu formaliny w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
3. Odessać 10% buforowaną formalinę za pomocą jednorazowej pipety i przemyć dwukrotnie 0,5 ml ultraczystej wody.
4. Do utrwalonych OB dodać 0,25 ml 40 mM roztworu barwiącego ARS (pH 4,2) rozpuszczonego w ultraczystej wodzie i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów/min.
5. Odessać roztwór barwiący za pomocą jednorazowej pipety i spłukać 1 ml ultraczystej wody. Powtórz ten krok 5–10 razy, aby usunąć niespecyficzne zabarwienie.
   nuta: Roztwór do płukania powinien być bez koloru.
6. Odessać ultraczystą wodę i dodać 1 ml zimnego PBS. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów/min.
7. Odessać PBS, przenieść poplamione dyski β-TCP do nowej studzienki i zeskanować płytki za pomocą skanera płaskiego, aby zarejestrować mineralizację.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
β-krążki fosforanu trójwapniowego (β-TCP, 14 mm)			Dyski spiekano w piecu muflowym w temperaturze 1150 °C. Szczegółowy opis produkcji można znaleźć w Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Próbki naświetlano promieniami UV (15 minut z każdej strony) przed użyciem w hodowlach komórkowych.
Pianka Orthovita Vitoss (pianka β-TCP/C)	Orthovita (Orthovita)	2102-1405
Alizaryna Czerwień S	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5533
Roztwór formaliny neutralny buforowany 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Pożywka do mineralizacji osteogennej (MM)			α-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina-streptomycyna + 50 μg/ml kwas askorbinowy + 5 mM β-glicerofosforan
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Woda ultraczysta: woda do hodowli komórkowych bez pirogenów	Firma VWR	L0970-500
Bufor do płukania			Dodaj 0,05% Tween20 do 1x PBS.
24-dołkowa płytka do hodowli zawiesiny	Greiner bio-one	662102
Skaner płaski: Epson Perfection 1200 Photo	Firmy Epson
Pipeta jednorazowa: pipeta do surowicy	Greiner bio-one	612301
woda destylowana	Carla Rotha	3478.4
Pipeta jednorazowa: pipeta do surowicy	Greiner bio-one	612301

TGL