1. Siew do hodowli komórek ekspansywnych i płytek CFU
- Zawiesić komórki (składające się z erytrocytów i komórek jednojądrzastych) w 50 ml podłoża podstawowego: Alpha-MEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2,5 mg/ml amfoterycyny B. Policz komórki rozcieńczone w stosunku 1:10 w roztworze błękitu trypanowego, używając komory Neubauera.
- Umieścić komórki w kolbach do hodowli komórkowych o gęstości 5 x 10⁷ komórek/cm² i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jeśli to możliwe, użyj warunków hipoksyjnych (5% tlenu). W przypadku kontroli testu CFU umieść 10⁹ komórek w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 10 cm.
- Po 3 dniach hodowli mezenchymalne komórki macierzyste są przyłączane do naczynia do hodowli komórkowej, podczas gdy inne komórki pozostają w zawiesinie. Zmienić pożywkę na podłoże podstawowe uzupełnione 5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). W przypadku kontroli testu CFU należy traktować szalkę z hodowlą komórkową w podobny sposób.
- Kontynuuj hodowlę komórkową w sumie przez 2 tygodnie, wymieniając pożywkę trzy razy w tygodniu. Jeśli komórki przekraczają 80% zbieżności, podziel je przez trypsynizację. W przypadku kontroli testu CFU należy również wymienić pożywki, ale nie należy dzielić komórek w ciągu dwóch tygodni.
2. Barwnik Giemsa do testu CFU
- Przygotować 10 ml roztworu Giemsy na każde naczynie: rozcieńczyć roztwór podstawowy (7,6 g/l Giemsa w glicerolu:metanolu) w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie (zawsze należy przygotować świeże robocze rozcieńczenie).
- Wyjmij pożywkę z naczynia do hodowli komórkowych i umyj komórki PBS. Zachowaj szczególną ostrożność podczas nakładania płynu na szalkę Petriego i unikaj zmywania komórek.
- Utrwalić komórki w czystym metanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć metanol. Dodać roztwór Giemsa i inkubować przez 60 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Umyj dwa razy PBS. Wysuszyć głowicę talerza na powietrzu na ręczniku papierowym. Policz kolonie ręcznie. Najlepiej osiągnąć to za pomocą markera umieszczonego na odwrocie tabliczki.