$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
UWAGA: Aspiraty szpiku kostnego psów z grzebienia biodrowego zostały pobrane za zgodą właściciela psa. Aspiraty szpiku kostnego u psów (ok. 10 ml) przeciwzakrzepowo stwierdzono przez dodanie 15 ml 3,8% cytrynianu sodu natychmiast po odstawieniu na sali operacyjnej. Próbki przeniesiono do środowiska laboratoryjnego w celu przetworzenia tego samego dnia, w którym zostały pobrane.
1. Przygotowanie urokinazy (przed pierwszym użyciem)
- Rozpuścić urokinazę przy użyciu sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z instrukcjami producenta: Dodać 10 ml PBS do kolby wlotowej przegrody za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Rozpuścić suchą masę przez wirowanie, aby uzyskać 50 000 jednostek iniekcyjnych (U) na ml.
- Przygotować 500 μl podwielokrotności (po 25 000 j. każdy) do sterylnych probówek. Przechowywać w temperaturze -20 °C i używać w razie potrzeby przez co najmniej 6 miesięcy.
2. Etapy przygotowawcze (przed każdym leczeniem szpiku kostnego)
- Rozmrozić jedną porcję urokinazy (25 000 j.) na zakrzepły aspirat szpiku kostnego (objętości aspiratu do 25 ml zostały skutecznie leczone przy użyciu pojedynczej podwielokrotności 25 000 j.).
- Podgrzej łaźnię wodną lub inkubator z wytrząsaniem do temperatury 37 °C.
3. Enzymatyczne trawienie skrzepu
- Wszystkie prace należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologicznego próbek szpiku kostnego podczas przetwarzania. Podczas pracy z potencjalnie zakaźnym materiałem ludzkim zaleca się stosowanie rękawic ochronnych, a także ostrożne obchodzenie się z nim.
- Umieść sitko o pojemności 100 μm na sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie przelej odessany szpik kostny przez sitko komórkowe, przechylając sitko lub poruszając się wokół materiału skrzepu. Użyj sterylnej końcówki pipety, aby uzyskać lepszy przepływ przez siatkę filtracyjną.
nuta: Należy unikać rozcieńczania skrzepu, np. poprzez przemywanie skrzepu PBS. Urokinaza działa pośrednio i do efektywnego trawienia wymaga składników surowicy (tj. plazminogenu) z biopsji. Kontynuując procedurę z materiałem skrzepowym, filtrat można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia w kroku 3.6.
- Przenieś materiał skrzepu szpiku kostnego do pustego naczynia do hodowli komórek za pomocą sterylnych kleszczy. Pokrój szczątki na małe kawałki o wielkości około 2 mm3 za pomocą sterylnego skalpela.
- Przenieść małe kawałki skrzepu do probówki reakcyjnej o pojemności 50 ml za pomocą sterylnych kleszczyków. Upewnij się, że zmielony skrzep ma mokry wygląd. Jeśli wydaje się, że jest suchy, użyj części filtratu z kroku 3.1, aby zwilżyć.
- Rozcierać skrzep, pipetując w górę i w dół przez 5 razy za pomocą pipety do mikromiareczkowania o pojemności 5 ml. Dodać 1 podwielokrotność urokinazy do próbki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej lub w inkubatorze z wytrząsaniem (delikatnie).
- Rozcierać pipetując w górę i w dół 5 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Inkubować przez kolejne 30 minut w temperaturze 37°C. Po inkubacji ponownie roztrzeć 5 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przepuścić przez świeże sitko o wielkości 100 μm do puli z filtratem z kroku 3.2.
- Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze otoczenia przez 10 minut przy 500 x g. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce, jak opisano poniżej lub zgodnie ze standardową procedurą laboratorium dla hodowli ekspansywnej MSC.
4. Siew do hodowli komórek ekspansywnych i płytek CFU
- Zawiesić komórki (składające się z erytrocytów i komórek jednojądrzastych) w 50 ml podłoża podstawowego: Alpha-MEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2,5 mg/ml amfoterycyny B. Policz komórki rozcieńczone w stosunku 1:10 w roztworze błękitu trypanowego, używając komory Neubauera.
- Umieścić komórki w kolbach do hodowli komórkowych o gęstości 5 x 10 7 komórek/cm2 i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jeśli to możliwe, użyj warunków hipoksyjnych (5% tlenu). Do kontroli testu CFU umieścić 109 komórek w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 10 cm.
- Po 3 dniach hodowli mezenchymalne komórki macierzyste są przyłączane do naczynia do hodowli komórkowej, podczas gdy inne komórki pozostają w zawiesinie. Zmienić pożywkę na podłoże podstawowe uzupełnione 5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). W przypadku kontroli testu CFU należy traktować szalkę z hodowlą komórkową w podobny sposób.
- Kontynuuj hodowlę komórkową w sumie przez 2 tygodnie, wymieniając pożywkę trzy razy w tygodniu. Jeśli komórki przekraczają 80% zbieżności, podziel je przez trypsynizację. W przypadku kontroli testu CFU należy również wymienić pożywki, ale nie należy dzielić komórek w ciągu dwóch tygodni.
5. Zróżnicowanie MSC
- Różnicowanie MSCs u psów
nuta: Psie MSCs różnicowano na linie chondrogenne, osteogenne i adipogenne poprzez stymulację odpowiednimi pożywkami przez cztery tygodnie.
- Różnicowanie chondrogenne
- Wytnij kostkę (3 mm z każdej strony) z wyrobu medycznego w kształcie gąbki, utworzonego z liofilizowanego kolagenu typu I i używanego jako materiał rusztowania do podtrzymywania komórek.
- Nasiona MSCs na wierzchu kostek w stężeniu 4 x 106 komórek/ml (~70 000 komórek/kostkę).
- Przed dodaniem pożywki pozwól komórkom przylegać do kostek przez 30 minut.
- Utrzymuj konstrukty kolagenu MSC w pożywkach chondrogennych składających się z DMEM/F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B, 40 ng/ml deksametazonu, 50 μg/ml 2-fosforanu kwasu askorbinowego, 50 μg/ml L-proliny, 1x Insulina-Transferyna-Selen X i 10 ng/ml transformujący czynnik wzrostu-β1.
- Użyj barwienia alcian blue, aby uwidocznić akumulację proteoglikanów w sekcjach konstruktów. Krótko zabarwić skrawki O/N 0,4% błękitu alcyjnego rozpuszczonego w 0,01% H2SO4 i 0,5M chlorowodorku guanidyny. Następnie umyj sekcje myto przez 30 min w 40% DMSO i 0,05M MgCl2. Komórki zostały podbarwione ogniem jądrowym.