Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Kwantyfikacja zwłóknienia tkanek
- Umieść tkankę serca utrwaloną paraformaldehydem na urządzeniu do cięcia tkanek i wytnij odcinki o grubości 2 mm. Umieść skrawki tkanki w kasecie do zatapiania. Odwodnić tkankę poprzez serię stopniowanych kąpieli alkoholowych (50%, 75%, 95% i 100% przez 1 godzinę każda).
- Naciekać tkankę ksylenem przez 1 godzinę, a na koniec w wosku przez 1 godzinę. Umieść naciekaną tkankę w kasecie do zatapiania i zatapiaj woskiem parafinowym. Przechowuj osadzone tkanki w blokach parafinowych w temperaturze pokojowej do czasu mikrotomizacji.
- Pokrój osadzoną tkankę na odcinki o grubości 4 μm. Umieścić sekcje w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C. Zanurz szkiełko szklane w łaźni wodnej pod kątem i stopniowo zbliżaj się do krawędzi sekcji parafinowej, aby umożliwić częściowe przymocowanie do szkiełka.
- Przesuwaj szkiełko do wanny i z powrotem, aby usunąć potencjalne kieszenie powietrzne pod sekcją tkankową i ułatwić lepsze mocowanie. Suszyć szkiełka w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i przechowywać je w temperaturze pokojowej do barwienia histologicznego.
- Włóż zjeżdżalnię do zbiornika. Odparafinować szkiełko ksylenem przez 30 minut i ponownie uwodnić je w kolejno rozcieńczonym alkoholu (95%, 75% i 50% przez 3 minuty), a na koniec w wodzie destylowanej. Użyj odpowiedniego roztworu czerwieni Picrosirius, aby całkowicie pokryć skrawki tkanki na 1 godzinę. Przepłukać szkiełka w 0,5% roztworze kwasu octowego na dwie przemiany, a następnie wykonać dwa płukania w bezalkoholowym roztworze.
- Wysuszyć szkiełko na powietrzu i zamontować szkiełko w żywicy syntetycznej z szkiełkiem nakrywkowym. Sfotografuj szkiełko w polu światła widzialnego.
nuta: Czerwony obszar na zdjęciu przedstawia czerwoną strefę dodatnią Picrosiriusa pod mikroskopem przy 200-krotnym powiększeniu. Oblicz procentową zawartość czerwonej strefy dodatniej picrosiriusa na całej powierzchni, która wskazuje na zakres zwłóknienia.
