Barwienie ligniny: technika charakteryzowania dystrybucji ligniny w skrawkach łodyg Arabidopsis thaliana

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Pradhan Mitra, P. et al., Barwienie histochemiczne wtórnych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2014).

W tym filmie opisujemy technikę barwienia Maule do barwienia ligniny syringylowej obecnej w wyspecjalizowanych komórkach roślinnych. Ta technika barwienia pomaga scharakteryzować rozkład ligniny we włóknach ksylemu i międzypęczkowych.

Protokół

1. Barwienie Mäule

Rozpuścić 0,2 g nadmanganianu potasu w 40 ml wody destylowanej, aby przygotować 0,5% roztwór nadmanganianu potasu. Przechowywać w ciemnej butelce w temperaturze pokojowej maksymalnie 7 dni.
1. Przygotować 3,7% roztwór HCl, dodając 1 ml stężonego HCl (37 N) do 9 ml wody destylowanej (1:10). Przygotuj świeży 3,7% roztwór HCl w dniu eksperymentu. Upewnić się, że używany roztwór podstawowy 37 N HCl nie jest zbyt stary. Stężony roztwór wodorotlenku amonu (14,8 M) powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C, aby zapobiec zmniejszeniu molowości nasyconego roztworu.
Przenieść sekcje trzpienia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Dodać 1 ml 0,5% roztworu nadmanganianu potasu do probówki zawierającej fragmenty.
1. Delikatnie odpipetować 0,5% roztwór nadmanganianu potasu w górę i w dół, najlepiej bez naruszania sekcji. Inkubować przez 2 minuty i powtórzyć pipetowanie. Pozostaw probówkę do mikrowirówki, aż wszystkie sekcje się usiądą.
  nuta: Należy uważać, aby nie pipetować sekcji do końcówki pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie. Może być trudno zobaczyć sekcje łodygi, ponieważ roztwór jest ciemny, więc trzymaj probówkę z sekcjami na stojaku na probówki i pozwól im osiąść przez 2 minuty.
2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać 700 μl 0,5% roztworu nadmanganianu potasu. Dodać 700 μl wody destylowanej, aby wypłukać roztwór nadmanganianu potasu. Powtórz 3-4 razy lub do momentu, gdy roztwór wodny pozostanie klarowny.
3. Wylej wodę. Szybko dodaj 1 ml 3% HCl, aż do uzyskania ciemnobrązowego koloru z sekcji. Może to nastąpić w ciągu 3-5 minut lub może wymagać 2 prań po 5 minut każde. Odpipetować cały 3% roztwór HCl i natychmiast przejść do następnego kroku.
4. Dodać 1 ml stężonego roztworu wodorotlenku amonu. Użyć pipety o pojemności 1 ml z końcówką przyciętą w taki sposób, aby można było łatwo odpipetować sekcje bez uszkodzeń. Delikatnie odpipetuj skrawki do końcówki i na szkiełko mikroskopowe. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj sekcje przy jasnym oświetleniu. (Rysunek 1)
  ostrożność: Ponieważ wodorotlenek amonu jest wyjątkowo, wymaga dodatkowej ostrożności i uwagi, aby uniknąć powodowania korozji na etapie mikroskopu lub soczewki.
  nuta: Opary wodorotlenku amonu mogą zaparowywać szkiełko nakrywkowe, utrudniając obserwację próbki. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność przed dodaniem szkiełka nakrywkowego. Roztwór wysycha w ciągu 5-10 minut, więc obrazowanie musi zostać zakończone w tym czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1. Barwienie Mäule przekrojów poprzecznych łodyg A. thaliana. Barwienie Mäule (kolor czerwony) dzikiego typu A. thaliana odcinka łodygi wykazujące normalne odkładanie się ligniny w ścianach włókien międzypęczkowych i komórek ksylemu (A-E). Wskazane są pozycje naskórka i kory (Ep), włókien międzypęczkowych (Fi), rdzenia (Pi) i ksylemu (Xy). Powiększenia: Panel A: 5X; Panel B: 10x; Panel C: 20X; Panele D i E: 40X. Bar = 100 μ...