Oczyszczanie białek oparte na chromatografii anionowej: technika rozdzielania mająca na celu wyizolowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania z dializowanego lizatu bakteryjnego na podstawie ładunku netto

Streszczenie

Źródło: Fuehner, S., et al. Oczyszczanie S100A12 ludzkiego i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii anionowo-wymiennej do oczyszczania ludzkiego białka wiążącego wapń S100A12 na podstawie ładunku powierzchniowego netto białka z hodowli Escherichia coli.

Protokół

1. Oczyszczanie białek

1. Chromatografia anionowymienna
   1. dializa
      1. Przygotować bufor A do chromatografii anionowymiennej (AIEX) przez rozpuszczenie 20 mM Tris, 1 mM EDTA i 1 mM kwasu bis(2-aminoetyloetero)-N (2-aminoetyloetero) glikolu etylenowego (EGTA) w wodzie dejonizowanej i dostosować pH do 8,5 za pomocą HCl. Do dializy przygotować 2 x 5 l, a do chromatografii 2 x 1 l buforu AIEX A.
         nuta: Objętość dializatu powinna być około 100 razy większa od objętości próbki. Wszystkie używane do chromatografii powinny być przefiltrowane (0,45 μm lub mniej) i odgazowane (np. przez kąpiel ultradźwiękową lub odgazowanie próżniowe).
      2. Przyciąć rurkę do dializy (odcięcie masy cząsteczkowej [MWCO]: 3,5 kDa) na odpowiednią długość z dodatkową przestrzenią na powietrze, aby zapewnić wyporność próbki powyżej obracającego się mieszadła.
         nuta: Glicerol konserwuje membranę i należy go usunąć przed użyciem.
      3. Aby zmniejszyć lepkość oczyszczonego roztworu białkowego, należy rozcieńczyć roztwór 25 ml buforu A AIEX, aby ułatwić późniejsze nałożenie na kolumnę chromatograficzną. Przymocuj pierwsze zamknięcie do rurki, załaduj próbkę do membrany i zamocuj drugie zamknięcie co najmniej 1 cm od górnego końca rurki.
      4. Umieścić 5-litrowy pojemnik z buforem AIEX A na talerzu mieszającym, dodać mieszadło i membranę wypełnić roztworem białka. Dostosuj prędkość, aby obrócić próbkę, unikając zakłóceń z obracającym się mieszadłem. Dializa przez 12−24 h w temperaturze 4 °C, następnie zastąpić bufor dializatu (bufor AIEX A) świeżym, wstępnie schłodzonym preparatem i kontynuować przez co najmniej dodatkowe 4 godziny. Przenieść dializowany roztwór białka do probówki o pojemności 50 ml i przefiltrować przez jednostkę filtrującą 0,45 μm.
         nuta: Możliwe przechowywanie.
   2. chromatografia
      1. Uruchomić system chromatografii cieczowej (FPLC) z ogólną konserwacją, podłączyć kolumnowe AIEX A i AIEX B (bufor AIEX A z 1 M NaCl) i kolumnę zawierającą żywicę anionowymienną. Ogólne parametry chromatograficzne znajdują się w Tabeli 1.
         nuta: , kolumny i urządzenia FPLC powinny być wyrównane do tej samej temperatury przed rozpoczęciem serii (patrz parametry chromatograficzne w Tabeli 1, Tabeli 2).
      2. Zrównoważyć kolumnę buforem A AIEX, a następnie załadować próbkę do kolumny i wymyć białka z gradientem liniowym od 0% do 100% buforu o wysokiej zawartości soli (AIEX B). Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem metody.
      3. Zebrać 2 ml frakcji podczas elucji i przeanalizować 10 μl każdej frakcji na elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z 15% dodecylosiarczanem sodu barwionym Coomassie (SDS-PAGE). Zebrać frakcje zawierające białko S100A12 do dializy.
         nuta: Masa cząsteczkowa S100A12 wynosi 10 575 Da.

Wyniki

Tabela 1: Szczegółowe informacje na temat stosowanych parametrów chromatografii anionowymiennej.

Objętość łóżka (CV)	75 ml
monitor	Absorbancja przy 280 nM
Maksymalne ciśnienie	3 bary
Bufor kolumny A	20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
25% HCl	Carl Roth	X897.1
4− 20% żeli białkowych Mini-PROTEAN TGX	BioRad	4561093
Roztwór odbarwiający Coomassie Briliant Blue R250	BioRad	1610438
Roztwór do barwienia Coomassie Briliant Blue R250	BioRad	1610436
Sól disodowa EDTA dwuwodna	Carl Roth	8043.1
EGTA	Carl Roth	3054.3
Q Sepharose Szybki przepływ	GE Healthcare	17-0510-01	Żywica do chromatografii anionowymiennej
Chlorek sodu (NaCl)	Carl Roth	3957.2
Wodorotlenek sodu	Carl Roth	P031.1
Podstawa Tris	Carl Roth	4855.3
0.45 &mikro; m Filtr strzykawkowy	Firma Merck	SLHA033SS
5 L miarki	Carl Roth	CKN3.1
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Corning	430829
Zamknięcia przewodów do dializy	Widmo	132738
Probówki do zbierania frakcji 5 mL	Greiner	115101
Spectra/Por Membrana do dializy (3,5 kDa)	Spectrum	132724
Jednostka filtrująca Steritop	Firma Merck	SCGPT01RE
Ä Oczyszczacz KTA UPC 10	GE Healthcare		System FPLC
Kolekcjoner frakcji	GE Healthcare	Frac-920
Mini proteuszowa komórka tetra	BioRad	1658000EDU
NanoPhotometer	Informacje	P330
pH	Drobiazg	765