Chromatografia oddziaływań hydrofobowych zależnych od wapnia: technika oczyszczania białek wiążących wapń na podstawie oddziaływań hydrofobowych

Streszczenie

Źródło: Fuehner, S., et al., Oczyszczanie S100A12 ludzkiej i jej indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych. J. Vis. Exp. (2019).

W tym filmie pokazujemy oczyszczanie białka wiążącego wapń z dializowanego lizatu komórkowego za pomocą zależnej od wapnia chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Białka wiążące wapń odsłaniają obszar hydrofobowy po związaniu z wapniem, ułatwiając interakcję z grupą hydrofobową na żywicy. Później białka te są eluowane za pomocą chelatora wapnia EDTA, który odwraca interakcję.

Protokół

1. Chromatografia hydrofobowa zależna od wapnia (HIC)

1. dializa
   1. Dializować roztwór białkowy w stosunku do 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5
2. chromatografia
   1. Przygotować 1 l buforu chromatograficznego HIC A, rozpuszczając 20 mM Tris, 140 mM NaCl i 25 mM CaCl2 w wodzie dejonizowanej i dostosować pH do 7,5. W przypadku buforu HIC B rozpuść 20 mM Tris, 140 mM NaCl i 50 mM EDTA. Dostosuj pH do 7,0, a następnie przefiltruj i odgazuj. Dodać CaCl2 do próbki do końcowego stężenia 25 mM i przefiltrować przez 0,45 μm. Zrównoważyć HIC i próbkę do temperatury 4 °C (temperatura kolumny).
   2. Uruchomić system chromatografii cieczowej z ogólną konserwacją, podłączyć kolumn HIC A i B oraz kolumnę. Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z dalszymi parametrami chromatograficznymi.
   3. Wyrównać kolumnę, załadować próbkę i rozciągnąć blok "przemywania próbki niezwiązanej" do momentu, gdy sygnał UV ponownie osiągnie poziom podstawowy. Następnie rozpocznij elucję za pomocą chelatora wapnia zawierającego bufor (EDTA). Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem metody.
      nuta: Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że nadmiar wapnia wydaje się być korzystny dla wiązania S100A12 z żywicą chromatograficzną.
   4. Zbierz frakcje szczytowe o wielkości 2 ml i przeanalizuj 10 μl każdej frakcji na 15% SDS-PAGE wybarwionej Coomassie. Zebrać czyste frakcje S100A12 i dializować z roztworem soli fizjologicznej buforowanym przez Hepes (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0).
      nuta: Współczynnik ekstynkcji S100A12 monomerycznej wynosi 2980 M-1 cm-1.

Wyniki

Tabela 1: Szczegółowe informacje na temat stosowanych parametrów chromatografii oddziaływań hydrofobowych.

blok	głośność	bufor	ujście
Równowagi	Objętości 1−2 kolumn (CV)	ZA	marnować
Przykładowe obc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
chemiczny
EDTA sól disodowa dwuwodna	Carla Rotha	8043.1
Fenylosefroza o wysokiej wydajności	GE Opieka zdrowotna	17-1082-01	Żywica do chromatografii oddziaływań hydrofobowych
Chlorek sodu (NaCl)	Carla Rotha	3957.2
wodorotlenek sodu	Carla Rotha	Zobacz materiał P031.1
Baza Tris	Carla Rotha	4855.3
25% HCl	Carla Rotha	Zobacz materiał X897.1
Dihydrat chlorku wapnia	Carla Rotha	5239.1
Sprzęt laboratoryjny
Filtr strzykawkowy 0,45 μm	Merck	SLHA033SS
Probówki okrągłodenne 14 ml	Bd	352059
Kolba Erlenmyera o pojemności 2 l	Carla Rotha	LY98.1
Probówki do kolektora frakcji 5 ml	Greiner	115101
Membrana do dializy Spectra/Por (3,5 kDa)	widmo	132724
Jednostka filtrująca Steritop	Merck	SCGPT01RE
sprzęt
Kolektor frakcji	GE Opieka zdrowotna	Frac-920