Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

Streszczenie

Źródło: Pokhrel, A. et al. A Oczyszczanie i test aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii powinowactwa niklu do oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną z bakterii Clostridium difficile.

Protokół

1. Oczyszczanie białek metodą chromatografii powinowactwa niklu

1. Oczyść białko za pomocą 1 ml żywicy kwasu niklowo-nitrylooctowego (Ni-NTA) na kolumnie grawitacyjnej.
   1. Dzień przed użyciem zrównoważyć kolumnę przez noc w temperaturze 4 °C z 2 ml buforu równoważącego (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 0,5 mg/ml lizozymu, 5 mM MgCl₂, 10 mM imidazolu, 0,25 mM DTT, 5 mM fluorku fenylometanu sulfonylu (PMSF), 10% glicerolu).
   2. Następnego dnia przestawić kolumnę z temperatury 4 °C do temperatury RT przed załadowaniem oczyszczonego lizatu i odstawić na ~2–3 godziny < br /> nuta: Doprowadzenie kolumny do równowagi termicznej ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia tworzenia się pęcherzyków powietrza w kolumnie.
   3. Zawiesić osad w buforze do lizy (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 10% glicerolu, 0,5 mg/ml lizozymu, 10 mM imidazolu, 0,25 mM DTT i 5 mM PMSF).
   4. Sonizuj komórki na lodzie w odstępach 8 x 10 s, robiąc 30 s przerwy między impulsami.
   5. Klarować lizat przez odwirowanie w stężeniu 3,080 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy użyciu mikrowirówki.
   6. Przygotować lizat z równymi objętościami buforu do lizy, a następnie nanieść przygotowany sklarowany lizat do kolumny i zebrać przepływ.
   7. Ponownie nanieść sklarowany przepływ lizatu do kolumny i zebrać przepływ wtórny.
   8. Przepłukać kolumnę buforem płuczącym 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 30 mM imidazol, 10% glicerol). Zebrać przepływ.
      UWAGA: Włączenie 5 mM MgCl₂ do płuczących i elucyjnych jest ważne dla aktywności enzymatycznej oczyszczonego białka.
   9. Przemyć kolumnę buforem płuczącym 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄ i 50 mM imidazolu).
   10. Zbierz przepływ.
   11. Zastosować 2 ml buforu elucyjnego (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 10% glicerolu i 75 mM imidazolu). Zebrać przepływ w dwóch frakcjach po 1 ml każda.
       nuta: Kolumna po tym etapie może być przechowywana w buforze równowagowym w temperaturze 4 °C, jeżeli to samo białko zostanie oczyszczone w następnym teście oczyszczania. Kolumna może być używana do 3 razy, jeśli jest odpowiednio przechowywana.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Żywica Ni-NTA	G Nauki biologiczne	786-940/941
Jednorazowe kolumny grawitacyjne Pierce, 10 ml	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 29924
1 ml urządzenia do dializy Spectra/Por float-A-lyzer G2 (MWCO: 20 kD)	widmo	G235033
Procesor ultradźwiękowy	Dźwięki	VC-750
Mikrowirówka z wirnikiem D3024/D3024R	Scilogex