$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Ekstrakcja całkowitej ilości niekowalencyjnie połączonych lipidów z prątków (Rysunek 1)
- Zeskrob 0,2 g prątków z pożywki stałej i dodaj do szklanej probówki z nakrętkami z wkładki z politetrafluoroetylenu (PTFE). Dodać roztwór składający się z 5 ml chloroformu i 10 ml metanolu (chloroform: metanol, 1:2).
nuta: W przypadku stosowania rozpuszczalników organicznych należy używać wyłącznie szklanego pojemnika. Pojemniki plastikowe nie są dozwolone. Ponadto potrzebne są nakrętki z wkładką PTFE do butelek.
ostrożność: Chloroform jest substancją potencjalnie toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Metanol jest substancją potencjalnie toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
- Pozostaw probówkę w ciągłym mieszaniu przez noc, aby wyekstrahować niekowalencyjnie połączone lipidy z powierzchni komórki prątków.
nuta: Jeśli orbitalna platforma wibracyjna nie jest dostępna, ciągłe mieszanie można zastąpić okresowym mieszaniem ręcznym tak często, jak to możliwe.
- Przykryj szklany lejek bibułą filtracyjną, przefiltruj rozpuszczalniki organiczne i zbierz je do szklanej probówki.
- Użyj strumienia azotu gazowego, aby odparować fazę ciekłą w rurce. Napełnij probówkę azotem gazowym, przykryj i przechowuj w temperaturze 4 °C.
nuta: Podłącz szklaną pipetę Pasteura do strumienia azotu gazowego, aby dokładnie odparować żądaną probówkę. Dodatkowo utrzymuj rurkę w suchym bloku grzejnym dla rur w temperaturze 37 °C. Gdy rozpuszczalnik odparuje, napełnij rurkę gazowym azotem przed jej zamknięciem.
- Dodać 15 ml roztworu chloroformu:metanolu (2:1) do resztek komórkowych. Pozostaw probówkę w ciągłym mieszaniu przez noc, aby wyekstrahować niekowalencyjnie połączone lipidy z powierzchni komórki prątków.
nuta: Jeśli orbitalna platforma wibracyjna nie jest dostępna, ciągłe mieszanie można zastąpić okresowym mieszaniem ręcznym tak często, jak to możliwe.
- Odstaw mieszaninę na 1 godzinę. Za pomocą pipety Pasteura odzyskaj rozpuszczalniki organiczne. Przykryj szklany lejek bibułą filtracyjną i przefiltruj rozpuszczalniki organiczne, a następnie zbierz je w tej samej szklanej probówce, która została poprzednio użyta w kroku 1.3. Użyj strumienia azotu gazowego, aby odparować fazę ciekłą w rurce. Napełnić probówkę azotem gazowym, zamknąć ją i ponownie przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Ekstrakcja kwasu mykolowego metodą metanolizy kwasowej (Rysunek 2A)
- Dodaj 2-5 ml roztworu estryfikującego do hermetycznej szklanej rurki z nakrętką z wkładki PTFE. Dodać 0,2 g biomasy prątków do szklanej probówki.
nuta: Roztwór estryfikacyjny powstaje przez zmieszanie 30 ml metanolu, 15 ml toluenu i 1 ml kwasu siarkowego. Komórki prątków można pobrać z kultur stałych lub nawet z komórek zdelipidowanych po przeprowadzeniu ekstrakcji całkowitych lipidów niezwiązanych kowalencyjnie z prątków (pozostałe komórki po przefiltrowaniu w kroku 1.6).
ostrożność: Toluen jest substancją łatwopalną i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Kwas siarkowy jest substancją i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
- Wymieszaj zawartość przez wirowanie. Pozostawić mieszaninę na noc w suchej kąpieli w temperaturze 80 °C.
- Pozwól probówce ostygnąć, aż osiągnie temperaturę pokojową, a następnie dodaj 2 ml n-heksanu do probówki. Mieszaj zawartość przez wirowanie przez 30 s i pozwól probówce osiąść, aż pojawią się dwie klarowne fazy.
UWAGA: n-heksan jest substancją potencjalnie łatwopalną, drażniącą, szkodliwą dla środowiska i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
- Odzyskać górną fazę odpowiadającą fazie n-heksanu. Przenieś go do nowej probówki.
- Powtórz krok 2.3. Ponownie odzyskać górną fazę i przenieść ją do tej samej probówki, która została użyta w kroku 2.4.
- Odparować zawartość probówki za pomocą strumienia azotu gazowego. Napełnij probówkę azotem gazowym, zamknij ją i przechowuj w temperaturze 4 °C.
3. Ekstrakcja kwasu mykolowego przez zmydlanie i metylację (Rysunek 2B)
- Zdrap 0,2 g prątków z podłoża stałego i dodaj do szklanej rurki z nakrętką z PTFE.
- Dodać 2 ml roztworu metanolu i benzenu (80:20) zawierającego 5% wodorotlenku potasu. Wymieszaj zawartość przez wirowanie. Podgrzewać mieszaninę przez 3 godziny w temperaturze 100 °C.
ostrożność: Benzen jest substancją łatwopalną, rakotwórczą i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
- Pozwól probówce ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać 20% kwasu siarkowego w celu zakwaszenia próbek, aby osiągnąć pH = 1.
- Dodać 3 ml eteru dietylowego. Delikatnie wymieszaj zawartość przez wirowanie.
- Niech uformują się dwie fazy przez osiadanie. Odzyskaj fazę eteru dietylowego i przenieś do nowej probówki. Powtórz krok prania w sumie trzy razy.
- Przemyć ekstrakt eteru dietylowego 2 ml wody destylowanej i przenieść górną część odpowiadającą eterowi dietylowemu do nowej probówki. Powtórz krok prania w sumie trzy razy.
- Dodać 2 g bezwodnego siarczanu sodu do ekstraktu z eteru dietylowego, aby go wysuszyć.
- Przefiltrować zawiesinę. Odparować zawartość za pomocą strumienia gazowego azotu.
- Aby przeprowadzić etap metylacji, rozpuść 3 g N-nitrozo-N-metylomocznika we wstępnie schłodzonym roztworze utworzonym przez 45 ml eteru dietylowego i 9 ml 40% KOH w wodzie destylowanej.
ostrożność: N-nitrozo-N-metylomocznik jest substancją toksyczną, drażniącą, rakotwórczą i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
- Przenieść supernatant (diazometan) do nowej kolby schłodzonej w lodzie zawierającej granulki wodorotlenku potasu (około 30 g).
nuta: Jeżeli supernatant nie zostanie natychmiast użyty, można go przechowywać w temperaturze -20 °C maksymalnie przez 1 godz.
ostrożność: Granulki wodorotlenku potasu są substancją drażniącą i. Materiał ten musi być używany w okapie z przepływem laminarnym, przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Diazometan jest wysoce toksyczny i potencjalnie wybuchowy. Należy go używać w okapie z przepływem laminarnym ze szkłem bezpiecznym, przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
- Dodać 2 ml roztworu eteru zawierającego diazometan, otrzymanego w kroku 3.10, do wysuszonego ekstraktu eteru dietylowego, który zawiera kwasy mykolowe, otrzymanego w kroku 3.8. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Odparować zawiesinę w temperaturze 40 °C. Napełnić probówkę azotem gazowym, zamknąć ją i przechowywać metylowane lipidy w temperaturze 4 °C.
nuta: Odparować diazometan z roztworu eteru pod okapem z przepływem laminarnym, aż eter straci żółty kolor.
4. Analiza metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
- Nasącz szklaną komorę TLC. W tym celu przykryj jedną ze ścian komory TLC kawałkiem bibuły filtracyjnej i pozwól jej zetknąć się z fazą ruchomą utworzoną przez mieszaninę rozpuszczalników. Umieść pozostałą objętość rozpuszczalnika na dnie komory TLC.
nuta: Dno komory TLC musi być pokryte co najmniej 1 cm fazy ruchomej. W obecnych eksperymentach wykorzystano różne fazy ruchome do opracowania TLC. Składały się one z 85 ml n-heksanu i 15 ml eteru dietylowego; 100 ml dichlorometanu; 90 ml chloroformu, 10 ml metanolu i 1 ml wody; 30 ml chloroformu, 8 ml metanolu i 1 ml wody; 60 ml chloroformu, plus 35 ml metanolu i 8 ml wody; 95 ml chloroformu plus 5 ml metanolu; i 90 ml eteru naftowego (60–80 °C) plus 10 ml eteru dietylowego.
nuta: W dwuwymiarowym TLC użyj n-heksanu:acetonu (95:5) w pierwszym kierunku trzy razy i użyj pojedynczego wywołania z toluenem:acetonem (97:3) w drugim kierunku, aby przeanalizować skład kwasu mykolowego. Aby przeanalizować PIM, użyj chloroformu:metanolu:wody (60:30:6) w pierwszym kierunku raz i użyj chloroformu:kwasu octowego:metanolu:wody (40:25:3:6) w drugim kierunku. Do analizy PDIM i AG należy trzykrotnie użyć eteru naftowego (60-80 °C): octanu etylu (98:2) w pierwszym kierunku i użyć pojedynczego wywołania z eterem naftowym (60-80 °C):acetonu (98:2) w drugim kierunku.
ostrożność: Eter dietylowy jest substancją potencjalnie toksyczną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Dichlorometan jest substancją potencjalnie toksyczną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Eter naftowy jest substancją potencjalnie łatwopalną, szkodliwą dla środowiska i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Kwas octowy jest substancją potencjalnie łatwopalną i. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Octan etylu jest substancją łatwopalną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Aceton jest substancją łatwopalną i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
- Zamknij komorę TLC, aby nasycić ją przez co najmniej 20 minut. W międzyczasie rozpuść lipidy obecne w szklanej probówce w 0,2-1 ml chloroformu.
nuta: Objętość użyta do rozpuszczenia lipidów może być modyfikowana w zależności od pożądanego lub oczekiwanego stężenia próbki.
- Nanieść 10 μl każdej zawiesiny za pomocą szklanej rurki kapilarnej bezpośrednio na płytkę TLC i pozostawić próbkę do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Próbki należy nakładać w dolnej części płytki, pozostawiając 1 cm z każdej strony. Próbki muszą być oddalone od siebie o co najmniej 0,5 cm. Po nałożeniu próbki na płytkę, probówki można ponownie odparować za pomocą azotu gazowego i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania.
- Włożyć płytkę do nasyconej komory TLC zawierającej fazę ruchomą. Pozwól, aby faza ruchoma przebiegała przez TLC.
nuta: Każdy ruch zastosowany w komorze TLC wpływa na pracujący rozpuszczalnik na płytce i wpływa na ruchliwość lipidów. W przypadku wykonywania dwuwymiarowej TLC, wymagane są dwie komory TLC, które muszą zawierać oba systemy elucji.
- Wyjąć płytkę z komory TLC, gdy rozpuszczalnik osiągnie odległość 1 cm od górnego końca płytki. Pozostawić płytkę pod strumieniem laminarnym do całkowitego wyschnięcia krzemionki.
nuta: W przypadku analizy składu kwasu mykolowego przy użyciu n-heksanu i eteru dietylowego (85:15) powtórz kroki 4.4 i 4.5 jeszcze dwa razy, aż do trzykrotnego przeprowadzenia fazy ruchomej na płytce TLC.
- Odsłoń płytkę z wymaganą plamą; w razie potrzeby podgrzej płytę.
nuta: W niniejszym eksperymencie do rozpylania płytek TLC użyto 15-20 ml następujących roztworów: 10% hydrat kwasu molibdetofosforowego w etanolu, aż płytka stanie się jasnożółta, a następnie podgrzanie płytki w temperaturze 120 °C; 5% w etanolu 20% α-naftolu w kwasie siarkowym, a następnie podgrzanie płytki do 120 °C; Odczynnik Molibden Blue (1,3% tlenek molibdenu w 4,2 M kwasie siarkowym) do momentu pojawienia się pasm fosforanowych lub 1% antronu w kwasie siarkowym.
ostrożność: Hydrat kwasu molibdatofosforowego jest substancją łatwopalną i. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Etanol jest substancją potencjalnie łatwopalną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
UWAGA: 1-Naftol jest substancją łatwopalną, i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
ostrożność: Odczynnik w sprayu Molibdenum Blue jest substancją, toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
