Oczyszczanie bakulowirusa oparte na chromatografii powinowactwa heparyny: technika izolowania bakulowirusa z supernatantu komórek owadów

Streszczenie

Źródło: Nasimuzzaman, M. et al., Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie demonstrujemy technikę izolacji bakulowirusa z supernatantu komórek owadów za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny. Izolację ułatwia powinowactwo heparyny w kolumnie do glikoproteiny otoczki bakulowirusa.

Protokół

1. Przygotowanie systemu chromatograficznego

1. Przygotować układ chromatograficzny, kolejno przepłukując próbkę i linie buforowe sterylną wodą, 1 N wodorotlenkiem sodu, wodą i buforem do przemywania (20 mM bufor fosforanu sodu zawierający 150 mM chlorku sodu, pH 7,0) przy liniowym natężeniu przepływu 50 ml/min.
2. Przygotować kolumnę o pojemności 50 μm heparyny (10 × 10 cm, 7,9 ml objętości kolumny (CV)) przez sekwencyjnie uruchamiany bufor do czyszczenia kolumny (5 CV sterylny 20 mM bufor fosforanu sodu 5 CV zawierający 2 M chlorek sodu, pH 7,0) i bufor płuczący 5 CV przy liniowym natężeniu przepływu 7 ml/min.

2. Oczyszczanie wektora bakulowirusa

1. Skonfigurować system chromatograficzny w następujący sposób:
   1. Użyj portu wlotowego ładowania próbki do załadowania supernatantu bakulowirusa.
   2. Użyj portu wlotowego bufora A1 do załadowania bufora myjącego. Przygotuj butelkę z co najmniej 500 ml buforu do płukania i umieść linię buforową do płukania w butelce.
   3. Użyć portu wlotowego buforu A2 do załadowania buforu elucyjnego (20 mM fosforanu sodu z 1,5 M chlorku sodu, pH 8,0). Przygotować butelkę z co najmniej 500 ml buforu elucyjnego i umieścić w niej przewód buforu elucyjnego.
   4. Włożyć kilka stożkowych probówek o pojemności 50 ml do kolektora frakcji, aby zebrać supernatant bakulowirusa przechodzącego przez kolumnę, bufor do przemywania i eluowany bakulowirus.
2. Zrównoważyć kolumnę z heparyną z pięcioma objętościami kolumny (CV) o pojemności 7,9 ml buforu do przemywania (40 ml) przy liniowym natężeniu przepływu 7,0 ml/min.
3. Załadować 250 ml supernatantu bakulowirusa do kolumny heparyny za pomocą pompy do pobierania próbek (port wlotowy próbki) systemu chromatograficznego przy liniowym natężeniu przepływu 2,0 ml/min.
4. Przepuścić 10 CV (80 ml) buforu płuczącego przez kolumnę z heparyną przy liniowym natężeniu przepływu 2,0 ml/min, aż krzywa absorbancji ultrafioletu (UV) (280 nm) powróci do wartości wyjściowej i stanie się stabilna.
5. Eluować cząstki bakulowirusa z kolumny heparyny o pojemności 7,9 ml za pomocą 5 CV (40 ml) buforu elucyjnego przy liniowym natężeniu przepływu 4,0 ml/min. Uważaj na ostry pik elucji białka na chromatogramie, gdy cząstki bakulowirusa dysocjują od kolumny heparyny.
6. Po elucji natychmiast rozcieńczyć wymyty supernatant bakulowirusa 10-krotnie, używając 20 mM buforu fosforanu sodu w wodzie, aby zapobiec inaktywacji cząstek bakulowirusa w wyniku wstrząsu osmotycznego podczas późniejszego wirowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Akta Avant 150	GE Opieka zdrowotna	28976337	System chromatograficzny
POROS Heparyna 50 μm Kolumna	ThermoFisher Naukowy	4333414	Kolumna z heparyną
Bufor do płukania	Na miejscu	Element spoza katalogu	20 mmol/l bufor fosforanowy zawierający 150 mmol/l chlorku sodu
Bufor elucyjny	Na miejscu	Element spoza katalogu	Bufor fosforanowy 20 mmol/l zawierający 1,5 mol/l chlorku sodu
Rurka stożkowa 50 ml	ThermoFisher Naukowy	14-959-49A	Do pobierania supernatantu bakulowirusa
Bufor do czyszczenia kolumny	Na miejscu	Element spoza katalogu	Bufor fosforanowy 20 mmol/l zawierający chlorek sodu o stężeniu 2,0 mol/l
Sterylna woda	Na miejscu	Element spoza katalogu	Do czyszczenia Akta Avant
wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 1.09137	Do czyszczenia Akta Avant