Chromatografia kationowymienna: technika izolowania docelowego białka rekombinowanego z lizatu komórek owadów na podstawie ładunku powierzchniowego netto

Streszczenie

Źródło: Agamasu, C. et al. W pełni przetworzony rekombinowany KRAS4b: Izolowanie i charakterystyka białka farnezylowanego i metylowanego. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje technikę chromatografii kationowymiennej do izolowania rekombinowanego białka z lizatu białka komórki owada.

Protokół

1. Oczyszczanie białka

1. Przygotować A–H, jak pokazano w Tabeli 1.

szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt.

Roztwór buforowy	Środek buforujący (wszystkie 20 mM)	ph	NaCl (mM)	Imidazol (mM)	MgCl2	Protokół TCEP
ZA	HEPESY	7,3	300	-	5	1
W	HEPESY	7,3	300	35	5	1
Z	HEPESY	7,3	300	500	5	1
D	Mes	6,0	200	-	5	1
E	Mes	6,0	-	-	5	1
Z	Mes	6,0	100	-	5	1
Z	Mes	6,0	1000	-	5	1
H	HEPESY	7,3	300	-	1	1

2. Przygotować materiały oczyszczające (patrz tabela materiałów): koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA i innych chelatorów; kolumna do chromatografii z immobilizowanym powinowactwem do metali (IMAC); kolumna do chromatografii kationowymiennej (CEX); filtr strzykawkowy 0,45 μm; 2 M imidazol (pH = 7,5); ultrawirówka o wydajności 100 000 x g; wirówka stołowa o dużej prędkości 4 000 x g; odśrodkowe jednostki filtracyjne (10 KDa NMWL); spektrofotometr zdolny do odczytu przy długości fali 280 nm; Proteaza wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) his6-tobacco etch virus; oraz oprzyrządowanie chromatograficzne zdolne do mieszania dwóch roztworów buforowych, nakładania roztworów na kolumny, tworzenia elucji gradientowych z kolumny i zbierania frakcji z kolumn.
3. Usunąć lizat komórek owadów z dializy i odwirować przy 4 000 x g przez 10 minut, aby usunąć wszelkie osady. Końcowa dializowana, oczyszczona próbka w tym momencie jest nadal często mętna, ale może być naniesiona bez dalszej obróbki na kolejną kolumnę CEX.
4. Przygotować kolumnę kationitową o pojemności 20 ml (patrz tabela materiałów), przemłukując trzema CV buforu G, a następnie trzema CV buforu F.
   nuta: Chociaż nie oceniliśmy skrupulatnie innych żywic, kilku kolegów stwierdziło słabą rozdzielczość żywic innych niż żywica SP Sepharose High Performance.
5. Rozcieńczyć 20 ml dializowanej próbki do końcowego stężenia NaCl wynoszącego 100 mM przez dodanie 20 ml buforu E i nanieść rozcieńczoną próbkę do kolumny kationitowej.
6. Kontynuować ładowanie kolumny, dodając świeżo rozcieńczone próbki przygotowane w sposób opisany powyżej do rurki obciążeniowej, ponieważ poprzednie rozcieńczenie zbliża się do końca wsadu.
   nuta: Rozcieńczenie całej próbki jednorazowo do 100 mM NaCl spowodowało znaczną utratę białka docelowego w wyniku wytrącania.
7. Umyj kolumnę do linii podstawowej Abs280 za pomocą buforu F. Zazwyczaj wymaga to 3 CV. Białko jest eluowane z kolumny podczas gradientu 400 ml (20 CV) od buforu F do 65% buforu G, zebranego we frakcjach o pojemności 6 ml (figura 1B).
8. Kontynuuj mycie kolumny przez dodatkowe 1,5 CV (65% buforu G) po zakończeniu gradientu.

Wyniki

Rysunek 1: Żele SDS-PAGE z procesu oczyszczania. A) Wychwyt IMAC z lizatu. FNTA/B to ciemne pasma migrujące z prędkością ~48 kDa, a His6-MBP-tev-KRAS4b to ciemne pasmo migrujące z prędkością ~67 kDa. M = drabina masy cząsteczkowej białka; T = białko całkowite; L = oczyszczony lizat/obciążenie kolumny; F = przepływ kolumny. Frakcje są eluowane z rosnącym gradientem stężenia imidazolu. (B

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki Safe-Lock 1,8 mL, naturalne	Eppendorf	22363204
Fiolki z automatycznym podajnikiem próbek 11 mm Cl SS z wkładką blokowaną	Thermo Scientific	30211SS-1232
5427R Wirówka	Eppendor
Acetonitryl, klasa HPLC	Fisher Chemiczny	A998-1 1L
Kolumna chromatografii kationowymiennej (CEX)	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	29018183	HiPrep SP Sepharose Wysoka wydajność
Spektrometr masowy Exactive Plus EMR	Thermo Scientific
Fiolki Gilson 7x14 mm Probówki	GE Opieka zdrowotna	Zobacz materiał BR-1002-12
Wirówka wysokoobrotowa/stołowa	Thermo Fischer Naukowy	05-112-114D	Możliwość przetwarzania do 4 000 xg
Proteaza wirusa TEV (His6-Tobacco Etch Virus)	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 92414	Oczyszczony zgodnie z Raran-Kurussi i in. (2017) Usuwanie znaczników powinowactwa za pomocą proteazy TEV. W: Burgess Brown N. (red.) Heterologiczna ekspresja genów w E.coli. Metody w biologii molekularnej, tom 1586. Humana Press, Nowy Jork, Nowy Jork
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA i innych chelatorów	Millipore Sigma	Zobacz materiał P8849
Octan amonu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 09689-250g
Gaz argonowy	Gaz powietrzny	ARUP (Organizacja ARUP)
kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	Użyj klasy odczynnika lub lepszej
System chromatograficzny NGC	Przedsiębiorstwo BioRad	78880002	System chromatograficzny NGC QuestTM 100
Zestaw ekstrudera lipidowego z uchwytem	LIPIDY POLARNE AVANTI	610023
Ciekły azot	Gaz powietrzny	NI-DEWAR
Filtry odśrodkowe Ultra-15, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	Membrana PES
Filtry wirówkowe Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 ml	Amicon (Amicon)	UFC501024
Ultrawirówka	Beckman Coulter	Optima - L80K	Zdolny do 100 000 XG
Żuchwy	Sigma	Zobacz materiał C3023