$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie
- Aby przygotować bufor płuczący ELISA, dodaj 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl i 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1 l wody dejonizowanej (DI). Dodać 500 μl polisorbatu-20. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą HCl lub NaOH.
- Aby przygotować bufor blokujący, dodaj 3,94 g zasady Tris, 8,77 g NaCl i 10 g BSA. Dodać 500 μl polisorbatu-20 do 1 l wody demineralizowanej. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą HCl lub NaOH.
- Aby przygotować bufor elucyjny (PBS), dodać 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 do 1 l wody DI. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl lub NaOH.
nuta: W razie potrzeby można przygotować 10-krotny roztwór tego buforu i rozcieńczyć go wodą DI.
2. Przygotowanie próbki OMV
- Hoduj komórki A. actinomycetemcomitans do późnej fazy wykładniczej (gęstość optyczna przy 600 nm 0,7). Granulować komórki przez dwukrotne odwirowanie w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,45 μm.
- Stężyć wolny od bakterii supernatant za pomocą filtrów odcinających o masie cząsteczkowej 50 kDa. Ultraodwirować stężony roztwór o stężeniu 105 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
- Zawiesić osad w PBS i ponownie odwirować (105 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min.) Zawiesić osad w 2 ml PBS.
3. Pakowanie kolumny S-1000
- Wymieszać podstawową butelkę z żelowym medium filtracyjnym ze szklanym prętem mieszającym i wlać do szklanej butelki objętość niezbędną do napełnienia kolumny plus około 50% nadmiaru (około 135 ml). Pozostaw te kulki na miejscu, aż opadną, a następnie zdekantuj nadmiar płynu. Ponownie zawiesić kulki w buforze elucyjnym, tak aby końcowy roztwór składał się w około 70% (objętościowo) żelu, 30% buforu. Odgazuj roztwór w próżni.
- Zamontuj szklaną kolumnę pionowo za pomocą stojaka pierścieniowego i napełnij buforem elucyjnym, aby zwilżyć ścianki kolumny. Opróżnij bufor, aż w kolumnie pozostanie tylko około 1 cm buforu.
- Nie tworząc bąbelków, ostrożnie wbij koraliki do kolumny, wypełniając kolumnę do góry. Kontynuuj opróżnianie nadmiaru bufora przez cały ten proces. Pamiętaj, aby nie pozwolić, aby koraliki całkowicie opadły przed dodaniem dodatkowych koralików na górze kolumny. Kolumna powinna być upakowana na wysokość około 2 cm poniżej dna zbiornika kolumny.
4. Ładowanie próbki i zbieranie frakcji
- Odgazowanie buforu elucyjnego w próżni. Przemyć kolumnę dwiema objętościami kolumny (180 ml) buforu elucyjnego.
- Poczekaj, aż pozostały bufor całkowicie wejdzie do kolumny. Gdy bufor dotrze do górnej części warstwy żelu, ostrożnie odpipetować 2-mililitrową próbkę zawierającą OMV (o stężeniu lipidów około 100 - 200 nmol/l) na powierzchnię kulek, uważając, aby nie naruszyć żadnego z kulek w górnej części kolumny. Pozwól, aby próbka całkowicie weszła do żelu, to znaczy, gdy żadna ciecz nie pozostaje nad warstwą żelu.
- Ostrożnie i powoli dodawać bufor elucyjny na wierzch kolumny żelowej. Nie należy naruszać wierzchniej warstwy żelu, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie próbki.
- Umieść pojedynczą probówkę o pojemności 50 ml pod kolumną i otwórz kolumnę. Zebrać pierwsze 20 ml eluentu. Dodać dodatkowy bufor elucyjny na górę kolumny, ostrożnie, w razie potrzeby, aby upewnić się, że kolumna nigdy nie jest sucha.
- Umieść serię probówek o pojemności 1,5 ml pod kolumną. Uruchomić kolumnę i zebrać serię próbek o pojemności 1 ml w każdej probówce. W miarę pobierania próbek, w razie potrzeby należy kontynuować dodawanie buforu elucyjnego do górnej części kolumny. Powtarzaj, aż zostanie zebranych 96 frakcji. Zatrzymaj kolumnę.
nuta: Próbki powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania do czasu dalszej analizy.
- Aby oczyścić kolumnę, przepuść przez nią jedną objętość kolumny (90 ml) 0,1 M NaOH. Przepuścić przez kolumnę dwie objętości (180 ml) buforu elucyjnego.