Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Podsumowanie

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Streszczenie

Dziedzina badań nad egzosomami gwałtownie się rozwija, co przejawia się w drastycznym wzroście liczby publikacji w ostatnich latach. Zaproponowano, że te małe pęcherzyki (30-100 nm) pochodzenia endocytycznego pełnią funkcję mechanizmu usuwania receptora transferyny przez retikulocyty podczas ich dojrzewania do erytrocytów¹, a później nazwano je egzosomami. Egzosomy powstają w wyniku pączkowania do wnętrza późnych endosomów, co prowadzi do tworzenia ciał wielopęcherzykowych (MVBs), a następnie są uwalniane do środowiska poprzez fuzję MVBs z błoną plazmatyczną². Od czasu pierwszego odkrycia egzosomów wykazano, że szeroki zakres komórek uwalnia te pęcherzyki. Egzosomy wykryto również w kilku płynach biologicznych, w tym w osoczu, płycie z płukania nosa, ślinie i mleku matki^3-6. Ponadto wykazano, że zawartość i funkcja egzosomów zależą od komórki macierzystej oraz warunków, w których są one wytwarzane. Wykazano szereg funkcji egzosomów, takich jak indukcja tolerancji na alergen^7,8, eliminacja utrwalonych guzów u myszy⁹, hamowanie i aktywacja komórek natural killer^10-12, promowanie różnicowania w limfocyty T regulatorowe¹³, stymulacja proliferacji limfocytów T¹⁴ oraz indukcja apoptozy limfocytów T¹⁵. W 2007 roku wykazaliśmy, że egzosomy uwalniane z komórek tucznych zawierają matrycowy RNA (mRNA) oraz mikroRNA (miRNA), a RNA może być transportowany z jednej komórki do drugiej za pośrednictwem egzosomów. Wykazano, że w komórkach biorczych mRNA transportowany przez egzosomy jest translacyjny na białko, co sugeruje funkcję regulacyjną przeniesionego RNA¹⁶. Ponadto wykazaliśmy, że egzosomy pochodzące z komórek hodowanych w warunkach stresu oksydacyjnego mogą indukować tolerancję na dalszy stres w komórkach biorczych, co sugeruje biologiczną funkcję egzosomalnego transportu RNA¹⁷. Pożywki do hodowli komórkowych i płyny biologiczne zawierają mieszaninę pęcherzyków i odszczepionych fragmentów. Wysokiej jakości metoda izolacji egzosomów, a następnie ich charakterystyka i identyfikacja wraz z analizą ich zawartości, jest zatem kluczowa dla odróżnienia egzosomów od innych pęcherzyków i cząsteczek. Przedstawiamy tutaj metodę izolacji egzosomów zarówno z pożywki do hodowli komórkowych, jak i z płynów ustrojowych. Metoda izolacji ta opiera się na powtarzanych etapach wirowania i filtracji, a kończy się etapem ultrawirowania, podczas którego egzosomy są osadzane w postaci pelletu. Omówiono istotne metody identyfikacji egzosomów oraz charakterystyki ich morfologii i zawartości białkowej, w tym mikroskopię elektronową, cytometrię przepływową i Western blot. Oczyszczanie całkowitego RNA egzosomalnego opiera się na chromatografii kolumnowej z wirowaniem, a wydajność i rozkład wielkości RNA egzosomalnego są analizowane przy użyciu Bioanalyzera.

Protokół

1. Izolacja egzosomów

1. Hodować komórki w pożywce z surowicą pozbawioną egzosomów. W związku z tym każda surowica dodawana do pożywki hodowlanej powinna zostać uprzednio oczyszczona z egzosomów poprzez ultrecentryfugację przy 120 000 x g przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Przenieść zawiesinę komórkową do probówek stożkowych.
3. Centryfugować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
4. Przenieść supernatant do probówek do ultrecentryfugowania i w razie potrzeby uzupełnić objętość za pomocą PBS.
5. Centryfugować próbkę przy 16 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby dodatkowo usunąć komórki i szczątki komórkowe.
6. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia cząsteczek większych niż 200 nm.
7. Przenieść przefiltrowany supernatant do nowych probówek do ultrecentryfugowania i szczelnie zamknąć probówki przed ultrecentryfugacją przy 120 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia egzosomów.
8. Odlać supernatant.
9. Aby uzyskać maksymalną odzyskowalność egzosomów, wielokrotnie resuspender osad wzbogacony w egzosomy w małej objętości (~3 x 50 μl) odpowiedniego buforu. Wybór buforu zależy od planowanych dalszych eksperymentów po izolacji egzosomów. Na przykład bufor do lizy jest stosowany do izolacji białek i RNA, PBS jest używany do mikroskopii elektronowej i cytometrii przepływowej, a do badań funkcjonalnych preferowana może być pożywka.

Uwaga; egzosomy można również izolować z różnych płynów ustrojowych, takich jak osocze, stosując tę samą procedurę co w przypadku pożywek hodowlanych. W przypadku płynów o dużej lepkości konieczne może być rozcieńczenie próbki w PBS przed etapem wirowania i filtracji. Odnośnie do prędkości wirowania w punkcie 5 powyżej, można ją zwiększyć do 29 500 x g, a ultrawirowanie w punkcie 7 można wydłużyć do 90 minut¹⁸.

Jeśli próbka wymaga dalszego oczyszczenia, osad egzosomów można poddać flotacji w gradiencie sacharozy; egzosomy będą występować głównie w frakcji odpowiadającej gęstości 1,13-1,19 g/ml².

2. Identyfikacja egzosomów za pomocą mikroskopii elektronowej

1. Aby dodatkowo usunąć zanieczyszczające białka, ponownie zawiesić pellet wzbogacony w egzosomy w PBS i poddać ultracentryfugowaniu przy 120 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, aby ponownie wytrącić egzosomy w formie pelletu.
2. Pobrać małą alikwot próbki do izolacji białek i pomiaru całkowitej zawartości białka. Należy upewnić się, że tylko niewielka część próbki zostanie poddana lizie i wykorzystana do pomiaru białka, natomiast nienaruszone egzosomy zawieszone w PBS należy przechowywać oddzielnie na lodzie lub w temperaturze -80 °C do dalszych eksperymentów.
3. Nanieść na Parafilm kroplę zawierającą około 10 μg białka egzosomalnego z nienaruszonych egzosomów zawieszonych w PBS. Następnie, za pomocą pęsety, delikatnie ułożyć na każdej kropli siatkę niklową powleczoną węglem i formvarem na 30-60 minut. Należy upewnić się, że siatka jest ułożona stroną z powłoką skierowaną w stronę kropli zawierającej egzosomy.
4. Nanieść na Parafilm trzy krople PBS, każda po 30 μl, i przemyć siatkę, kolejno przenosząc ją na krople PBS, używając pomiędzy nimi papieru absorbującego. Papier absorbujący należy stosować delikatnie, przytrzymując go blisko krawędzi siatki, bez kontaktu z obszarem powleczonym.
5. Utrwalić próbkę, nanosząc na Parafilm kroplę 2% paraformaldehydu i kładąc siatkę na kropli na 10 minut.
6. Powtórzyć etap płukania opisany w punkcie 4 przed immunostainingiem z zastosowaniem odpowiedniego przeciwciała. Powszechnie stosowane przeciwciała to anty-CD63 oraz anty-MHC klasy II. Mikroskopia elektronowa może być również przeprowadzona bez immunostainingu, ponieważ egzosomy można zidentyfikować wyłącznie na podstawie wielkości i morfologii. Zaleca się jednak ocenę wielkości, morfologii oraz obecności białka błonowego w celu uzyskania bardziej rozstrzygającej walidacji.
7. Przenieść siatkę do 30 μl kropli wybranego przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować przez 40 minut. Przemyć, powtarzając czynność z punktu 4, ale zamiast samego PBS użyć 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
8. Powtórzyć czynność z punktu 7, ale z zastosowaniem przeciwciała drugorzędowego znakowanego złotem 10 nm i przemyć samym PBS.
9. Dofiksować próbkę, dodając na Parafilm kroplę 2,5% glutaraldehydu i inkubując siatkę na kropli przez 10 minut. Powtórzyć płukanie z punktu 4, ale zamiast trzech kropli PBS użyć pięciu kropli wody dejonizowanej.
10. Poddać próbkę kontrastowaniu, dodając na Parafilm kroplę 2% octanu uranylu i inkubując siatkę na kropli przez 15 minut.
11. Zatopić próbkę, dodając na Parafilm kroplę 0,13% metylocelulozy i 0,4% octanu uranylu, a następnie inkubować siatkę na kropli przez 10 minut.
12. Usunąć nadmiar cieczy, delikatnie używając papieru absorbującego, a następnie położyć siatkę na papierze stroną z powłoką do góry i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.
13. Zbadać preparaty pod mikroskopem elektronowym lub przechowywać siatki w pudełku na siatki do przyszłych prac.

3. Charakterystyka egzosomów metodą cytometrii przepływowej

Ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby mogły zostać wykryte przez obecny sprzęt do cytometrii przepływowej, konieczne jest uprzednie związanie egzosomów z kuleczkami pokrytymi przeciwciałami (Rysunek 1). Kuleczki te można nabyć jako gotowy produkt lub przygotować w laboratorium, stosując odpowiednie przeciwciało. W zależności od pochodzenia komórkowego egzosomów, do kuleczek – które mogą być magnetyczne lub lateksowe – można przyłączyć różne przeciwciała. W niniejszej analizie obecnie stosujemy kuleczki pokryte przeciwciałami anty-MHC klasy II lub anty-CD63.

1. W przypadku stosowania „samodzielnie przygotowanych” kulek pokrytych przeciwciałami, używamy 4 μm lateksowe koraliki pokryte przeciwciałem anty-CD63. Przemyć 25 μl 4 μm kuleczki lateksowe (30 x 10⁶ kuleczki) dwukrotnie w 100 μl bufor MES, 3 000 x g przez 15–20 minut, a następnie ponownie rozpuścić osad w 100 μl bufor MES. Przygotować mieszaninę przeciwciał zawierającą objętość równą 12.5 μg przeciwciała taką samą objętością buforu MES. Dodać kulki do mieszaniny przeciwciał i inkubować w warunkach mieszania przez noc w temperaturze pokojowej. Przemyć kulki pokryte przeciwciałami trzykrotnie za pomocą PBS (3 000 x g przez 20 minut) i rozpuścić osad w 100 μl buforu do przechowywania (z końcowym stężeniem 300 000 kulek/μl).
2. Dla każdej próbki (każdego przeciwciała) kontynuować, stosując objętość równą co najmniej 30 μg białka egzosomalnego (z nienaruszonych egzosomów rozpuszczonych w PBS) na ok. 100 000 kuleczek powlekanych przeciwciałami.
3. Inkubować egzosomy i kuleczki w całkowitej objętości 300 μl PBS, przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu.
4. Blokowanie poprzez dodanie 300 μl z 200 mM glicyną i inkubować przez 30 minut.
5. Kompleksy egzosom-bead przemyć dwukrotnie w buforze do przemywania (1–3% surowicy w PBS), wirując przy 600 x g przez 10 minut.
6. Inkubować kompleksy egzosom-beads z 50 μl przeciwciało IgG w stężeniu 4 °CKompleksy egzosom-perełka przemyć dwukrotnie w buforze do przemywania zgodnie z opisem w kroku 5.
7. Dodaj 90 μl bufor płuczący i 10 μl odpowiednie przeciwciało (najlepiej anty-CD9, anty-CD63 lub anty-CD81) do kompleksów egzosom-perełka i inkubować przez 40 minut przy łagodnym mieszaniu. Przemyć kompleksy egzosom-perełka dwukrotnie w buforze do przemywania, zgodnie z opisem w kroku 5.
8. Dodaj 300 μl przemyć buforem do płukania i zebrać dane za pomocą cytometrii przepływowej.

Jak omówiono powyżej, można zastosować różne rodzaje kulek, takie jak kulki lateksowe opisane w protokole lub kulki magnetyczne. W przypadku zastosowania kulek magnetycznych należy pamiętać, że protokół jest nieco inny. Krok blokowania (punkt 4) nie jest wymagany, a płukanie przeprowadza się poprzez umieszczenie probówki w statywie magnetycznym zamiast wirowania w wirówce.

Bufor do przechowywania wykorzystywany dla „domowych” kulek powlekanych przeciwciałami zawiera 0,1% glicyny i 0,1% azotku sodu w PBS o pH 7,2.

Ważne jest, aby do buforu płuczącego w cytometrii przepływowej (1-3% surowicy w PBS) użyć surowicy pozbawionej egzosomów, aby uniknąć zanieczyszczenia analizy egzosomami z surowicy.

Uwaga: podczas przeprowadzania charakterystyki egzosomów z wykorzystaniem kulek sprzężonych z przeciwciałami należy pamiętać, że izolowana i charakteryzowana jest jedynie specyficzna subpopulacja, właściwa dla użytego przeciwciała.

4. Wykrywanie egzosomów metodą Western blot

Western blot jest dobrze ugruntowaną metodą, dlatego nie będziemy szczegółowo omawiać samej procedury, lecz skupimy się na znaczeniu odpowiedniej izolacji białek przed analizą Western blot oraz na zastosowaniu różnych przeciwciał.

1. Osad egzosomów rozpuścić w wybranym buforze do lizy białek, dokładnie pipetując, a następnie mieszając w wstrząsarze typu vortex. Aby dokończyć lizę egzosomów, próbkę sonykować w łaźni wodnej 3 x 5 minut, mieszając w międzyczasie w wstrząsarzu typu vortex. Na koniec odwirować próbkę z prędkością 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść nadsącz do nowej probówki typu Eppendorf.
2. Oznaczyć całkowitą zawartość białka wybraną metodą i nanieść 20-50 μg białka na każdą studzienkę.
3. Rozdzielić i przenieść białka za pomocą elektroforezy żelowej oraz transferu białek (electroblotting).
4. Zablokować i przemyć membranę przed przeprowadzeniem immunobarwienia przeciwko białkom wzbogaconym w egzosomach.
5. Wykryć specyficzne białko za pomocą chemiluminescencji, cyfrowego systemu obrazowania oraz oprogramowania analitycznego.

Ponieważ nie istnieją specyficzne markery egzosomów, do ich wykrywania powszechnie stosuje się białka wzbogacone w egzosomach pochodzące z różnych typów komórek. Są to białka takie jak tetraspaniny (np. CD9, CD63 i CD81), białka związane z cytoszkieletem (np. ezryna) oraz białka zaangażowane w biogenezę ciałek wielopęcherzykowych (np. Tsg101 i alix). Innymi białkami często wykrywanymi w egzosomach są flotyllina, Hsc70 oraz różne białka rab itp. W egzosomach znajdują się jednak również białka specyficzne dla danych komórek, takie jak A33 (komórki nabłonkowe jelit), CD3 (limfocyty T) i MHC klasy II (komórki prezentujące antygen). Zatem w zależności od tego, z jakiego typu komórek uwalniane są egzosomy, markery służące do ich wykrywania mogą się różnić.

Ponieważ inne kompartmenty komórki również mogą wytwarzać pęcherzyki, zaleca się dodatkowo określić obecność białek z tych kompartmentów, takich jak siateczka śródplamkowa (np. kalneksyna i Grp78) oraz aparat Golgiego (np. GM130). W związku z tym brak tych białek wskazuje na brak lub niewielkie zanieczyszczenie pęcherzykami z innych kompartmentów w badanej próbce.

5. Izolacja RNA egzosomalnego i analiza RNA

1. Rozpuścić osad egzosomów w wybranym buforze do lizy RNA i przeprowadzić ekstrakcję RNA. W zależności od planowanych dalszych eksperymentów można zastosować różne zestawy do izolacji RNA, jednak metody kolumnowe pozwalają uzyskać próbki o szerszym spektrum RNA. Obecnie stosujemy zestaw miRCURY RNA Isolation Kit firmy Exiqon, ale w zależności od stawianego pytania badawczego odpowiednie mogą być inne zestawy.
2. Podczas izolacji RNA istotne jest praca w środowisku wolnym od RNaz. Należy zatem używać końcówek do pipet wolnych od nukleaz i kwasów nukleinowych oraz przetrzeć blat i sprzęt, aby usunąć z nich zanieczyszczenia i RNazy.
3. W przypadku izolacji RNA przy użyciu zestawu miRCURY RNA Isolation Kit, rozpuścić osad egzosomów w 350 μl roztworu do lizy i mieszać w wstrząsarze wirowym (vortex) przez 15 sekund.
4. Dodać 200 μl 95% etanolu i mieszać w wstrząsarzu wirowym przez 10 sekund.
5. Umieścić kolumnę w probówce zbiorczej, przenieść zlizowane egzosomy do kolumny i wirować przez 1 minutę przy 14 000 x g.
6. Przepłukać trzy razy, dodając do kolumny zawierającej RNA egzosomalne 400 μl roztworu do płukania (Wash Solution), a następnie wirować przez 1 minutę przy 14 000 x g.
7. Wirować kolumnę przez 2 minuty przy 14 000 x g, aby upewnić się, że kolumna jest sucha, a następnie umieścić suchą kolumnę w probówce typu Eppendorf wolnej od RNaz.
8. Dodać do kolumny 50 μl buforu do elucji i wirować przez 2 minuty przy 200 x g, a następnie przez 1 minutę przy 14 000 x g.
9. Kontynuować pracę z wyizolowanym RNA lub przechowywać je w temperaturze -80 °C.

Do detekcji i analizy wyekstrahowanego całkowitego RNA egzosomalnego należy użyć analizatora Agilent 2100 Bioanalyzer z zestawem RNA 6000 Nano lub RNA 6000 Pico Kit. Analiza pozwala określić wydajność i rozkład wielkości RNA egzosomalnego.

6. Reprezentatywne wyniki

Egzosomy są zbyt małe, aby można było je wykryć za pomocą dostępnych metod cytometrii przepływowej, dlatego przed analizą są one przyłączane do kuleczek pokrytych przeciwciałami (Rycina 1). Ponieważ kompleksy egzosom-kuleczka mogą ulegać agregacji, wykres rozproszenia w cytometrii przepływowej może zawierać różne populacje pojedynczych, podwójnych i potrójnych kuleczek (Rycina 2A). Strzałka wskazuje pojedyncze kuleczki, które są analizowane w dalszych etapach. Populację pojedynczych kuleczek z egzosomami dodatnią pod kątem CD63 w porównaniu z kontrolą izotypową przedstawiono na Rycynie 2B.

Ze względu na niewielki rozmiar egzosomów, można je bezpośrednio wizualizować jedynie za pomocą mikroskopii elektronowej, a nie mikroskopii świetlnej. Typowe cechy morfologiczne egzosomów to pęcherzyki błonowe o okrągłym kształcie i rozmiarach 30-100 nm. Na Ryc. 3 fotografie z mikroskopii elektronowej przedstawiają egzosomy poddane immunostynowaniu (A) z użyciem przeciwciała przeciwko CD63 znakowanego złotem (wskazanego strzałką) oraz egzosomy niepoddane immunostynowaniu (B).

Aby potwierdzić, że wyizolowane pęcherzyki są rzeczywiście egzosomami, oraz w celu dalszej charakterystyki białek egzosomalnych, powszechnie stosuje się metodę Western blot. Rysunek 4 pokazuje brak kalneksyny, która jest markerem retikulum endoplazmatycznego. Wskazuje to na niewielkie zanieczyszczenie pęcherzyków materiałem z retikulum endoplazmatycznego. Ponadto Rysunek 4 wykazuje obecność CD81 w egzosomach, co jest tetraspanyną często wzbogaconą w egzosomach.

Komórkowe RNA składa się głównie z rybosomalnego RNA (rRNA), co objawia się jako dwa wyraźne piki dla podjednostek 18S i 28S rRNA w analizie Bioanalyzer (Rycyna 5A). Jednak RNA egzosomalne różni się pod względem profilu, ponieważ w egzosomach brakuje dwóch pików rRNA (18S i 28S), a są one wzbogacone w krótkie RNA, takie jak mRNA i miRNA (Rycina 5B).

Rysunek 1. Ze względu na niewielki rozmiar egzosomów (30-100 nm), nie można ich odróżnić od szumu i tła podczas analizy metodą cytometrii przepływowej. Dlatego konieczne jest przywiązanie ich do kulek pokrytych przeciwciałami przed analizą egzosomów, co umożliwia ich późniejszą wizualizację za pomocą lasera.

Rysunek 2. Kompleksy egzosom-perełka mogą agregować ze sobą, tworząc podwójne i potrójne perełki (A). Strzałka wskazuje populację pojedynczych perełek-egzosomów, która została wyselekcjonowana (gating) i wykorzystana do dalszych analiz. Populacja ta zostanie bezpośrednio porównana z kontrolą izotypową (wypełniony szary pik) w celu ustalenia obecności cząsteczek błonowych egzosomów. Egzosomy dodatnie pod kątem CD63 (czarny pusty pik) przedstawiono na rysunku B.

Rysunek 3. Mikrofotografie elektronowe egzosomów o typowej morfologii i rozmiarze (40-80 nm) (A i B). Strzałka na rysunku A wskazuje cząsteczkę złota przeciwciała wtórnego, potwierdzając, że ten egzosom posiada CD63 na powierzchni błony.

Rycina 4. Wyniki Western blot wykazujące brak białka siateczki śródplazmatycznej – kalneksyny, przy jednoczesnej obecności białka często wzbogaconego w egzosomach, tetraspaniny CD81.

Rycina 5. Wyniki Bioanalyzatora wykazujące obecność RNA w komórkach (A) i egzosomach (B). Strzałki wskazują podjednostki 18S i 28S rRNA obecne w komórkach. Ponieważ RNA egzosomalne zawiera głównie małe RNA, w egzosomach nie zidentyfikowano lub zidentyfikowano niewielką ilość rRNA.

Dyskusja

Podczas badania zawartości molekularnej i/lub funkcji egzosomów kluczowe jest zastosowanie wysokiej jakości metody izolacji, która zapewni odpowiednią wydajność i możliwie najniższy stopień zanieczyszczeń. Metodologia opisana w niniejszej pracy stanowi uznane podejście do izolacji egzosomów oraz badania ich zawartości RNA i funkcji biologicznych. Ponadto podkreślono znaczenie charakterystyki wyizolowanych egzosomów za pomocą kombinacji różnych metod, w tym mikroskopii elektronowej, cytometrii przepływowej i analizy Western blot.

Podczas izolacji egzosomów pierwszy etap wirowania (300 x g) służy do osadzenia komórek, które mogą znajdować się w zawiesinie komórkowej lub badanym płynie biologicznym. Drugie wirowanie przy 16 500 x g musi być wystarczająco silne, aby osadzić martwe komórki, większe fragmenty debris, ciała apoptotyczne oraz inne organelle. Po tym wirowaniu niektóre protokoły obejmują etap nanofiltracji, jednak część badaczy pomija ten krok. Podkreślamy jednak znaczenie eliminacji fragmentów i pęcherzyków o rozmiarach większych niż 200 nm, dlatego zdecydowanie zalecamy zastosowanie etapu filtracji. Jeśli wymagana jest bardziej rygorystyczna izolacja, można użyć filtrów 100 nm, należy jednak pamiętać, że w przypadku stosowania płynów lepkich filtry te mogą zostać łatwo zablokowane, co prowadzi do utraty materiału egzosomalnego. Ponadto filtracja 100 nm może wpływać na morfologię egzosomów, a w przypadku egzosomów o większych rozmiarach mogą one zostać utracone. Zatem filtry 200 nm wydają się odpowiednie do izolacji egzosomów. Po filtracji stosuje się obowiązkową ultrawirowkę przy 120,000 x g w celu osadzenia egzosomów. Egzosomy można następnie przemyć PBS, związać z kuleczkami powleczonymi przeciwciałami i przemyć lub poddać gradientowi sacharozy w celu usunięcia zanieczyszczających białek. Może to być jednak proces bardzo zasobożerny, który naszym zdaniem nie jest konieczny, szczególnie gdy objętość próbki wyjściowej jest mała i/lub zawartość RNA w egzosomach jest niska, ponieważ dodatkowe etapy znacząco zmniejszą ilość materiału. Niemniej jednak, charakter wyizolowanych pęcherzyków powinien zostać potwierdzony poprzez obecność lub brak określonych białek.

Do tej pory nie zidentyfikowano absolutnie unikalnego markera białkowego dla egzosomów, który pozwalałby potwierdzić, że próbka zawiera wyłącznie egzosomy. W związku z tym do charakterystyki egzosomów wymagane jest zastosowanie kombinacji metod, w tym określenie ich wielkości i morfologii za pomocą mikroskopii elektronowej. Mikroskopia elektronowa pozwala również na ocenę czystości próbki, ponieważ metoda ta umożliwia uzyskanie ogólnego obrazu poziomu zanieczyszczeń, na przykład większymi pęcherzykami, takimi jak mikrocząstki, ciałka apoptotyczne czy szczątki komórkowe. Ponadto zawartość białek w egzosomach można określić za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot, a połączenie tych dwóch metod pozwala na analizę zarówno białek związanych z błoną (np. CD63 i CD81), jak i białek wewnętrznych (np. Tsg101 i alix) egzosomów. Wykrycie białek wzbogaconych w egzosomach, takich jak CD63, Tsg101 i alix, przy jednoczesnym braku białek takich jak białko retikulum endoplazmatycznego kalneksyna, jest wskazaniem, że osad wzbogacony w egzosomy rzeczywiście składa się z egzosomów, a nie z zanieczyszczających pęcherzyków pochodzących z innych przedziałów komórki.

Profil RNA wykrywanego w egzosomach różni się zasadniczo od profilu RNA występującego w nienaruszonych komórkach. W związku z tym w analizie RNA egzosomalnego za pomocą Bioanalyzera lub metod opartych na żelach brakuje dwóch pików odpowiadających podjednostkom rRNA 18S i 28S, które są wyraźnie widoczne w analizie RNA komórkowego. Twierdzimy zatem, że wykrycie jakichkolwiek istotnych ilości rRNA w próbce wskazuje, że wyekstrahowane RNA całkowite nie pochodzi wyłącznie z egzosomów, a co za tym idzie, metoda izolacji wymaga udoskonalenia i zapewnienia kontroli jakości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ultrawirówka Optima L-90K	Beckman Coulter Inc.	65670
Probówki do ultrawirówek Quick-seal	Beckman Coulter Inc.		W zależności od użytego rotora wymagane są różne probówki. Ti70 (342414), Ti45 (345776)
Zestaw do zamykania probówek Quick-Seal Cordless Tube Topper	Beckman Coulter Inc.	358312
Filtr strzykawkowy Filtropur, 0,20μm	Sarstedt Ltd	83.1826.001	W przypadku cieczy lepkich i/lub dużych objętości można zamiast tego zastosować system filtracji próżniowej, 0,2 μm, firmy VWR International (514-0600).
Siatki niklowe pokryte formwarem/węglem	Ted Pella, Inc.	1GN200
Przeciwciało mysie przeciwludzkie CD63	BD Biosciences	556019	Stężenie końcowe: 0,05μg/μl
Kontrola izotypowa; IgG1κ (MOPC 21)	Sigma-Aldrich	M9269	Stężenie końcowe: 0,05μg/μl
Koniugat złota przeciw mysiej IgG, 10 nm	Sigma-Aldrich	G7777	Stężenie końcowe: 1%
Mikroskop elektronowy LEO 912AB Omega	Carl Zeiss, Inc.		Lub urządzenie równoważne.
Lateksowe kuleczki aldehydowe/siarczanowe 4μm	Interfacial Dynamics	12-4000
Przeciwciało do powlekania kuleczek lateksowych			Na przykład anti-CD63 z BD Bioscience (556019)
Mieszalnik Intelli-Mixer RM-2L	ELMI		Lub urządzenie równoważne.
IgG z surowicy ludzkiej	Sigma-Aldrich	I4506
Przeciwciała do detekcji	BD Biosciences		Na przykład: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) kontrola izotypowa (555749)
BD FACSAria	BD Biosciences
Myjka ultradźwiękowa Transsonic T 490 DH	ELMA		Lub urządzenie równoważne.
Zestaw do izolacji RNA miRCURY RNA Isolation Kit	Exiqon A/S	300110
Bioanalizator Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939A