1. Wyprodukuj i scharakteryzuj przeciwciało
- Wyraź przeciwciało
- Rozmrozić fiolkę z komórkami zawiesiny HEK w kolbie o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki ekspresyjnej uzupełnionej o 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C z 8% CO2 w nawilżanych inkubatorach wyposażonych w wytrząsarkę z prędkością 125 obr./min. Podziel komórki na 0,3-0,5 x 106 komórek/ml (co 2-3 dni) co najmniej 2 razy przed transfekcją.
- Po osiągnięciu gęstości 2,5 x 106 komórek/ml (2-3 dni po rozszczepieniu) przygotuj świeży roztwór 100 mM CypK. W tym celu odważyć 64 mg CypK, dodać 2,5 ml 0,1 wodorotlenku sodu, odwirować, odwirować, aby odzyskać wszystkie nierozpuszczone cząstki i sonikatować.
- Dodać 2,5 ml CypK (100 mM w 0,1 M NaOH) do 42,5 ml pożywki ekspresyjnej uzupełnionej antybiotykami. Dobrze wymieszaj, dodaj 250 μl 0,1 M HCl i wysterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm.
- Rozcieńczyć 50 μg plazmidów HC i LC pKym1 do 2,5 ml zredukowaną pożywką surowicy. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 135 μl odczynnika do transfekcji do 2,5 ml zredukowaną pożywką surowicy.
- Pięć minut po przygotowaniu roztworów wymieszać plazmidy i roztwór odczynnika do transfekcji i inkubować przez 20 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksów między DNA a odczynnikiem do transfekcji.
- W międzyczasie odwirować 125 milionów komórek o gęstości docelowej przez 5 minut przy 500 x g, ponownie zawiesić z pożywką ekspresyjną zawierającą CypK i dodać mieszaninę odczynnika do transfekcji DNA. CypK można kupić lub zsyntetyzować, jak opisano wcześniej.
- Po inkubacji komórek przez 20 godzin dodać 250 μl wzmacniaczy odczynników do transfekcji zawartych w zestawie.
- Przeciwciała należy pobrać z supernatantu 6-7 dni po dodaniu CypK (nie jest wymagana zmiana pożywki podczas odciągania).
*Alternatywnie, aby uzyskać wyższe i bardziej spójne plony, można wygenerować stabilną linię komórkową, jak opisano w Oller-Salvia i in. 2018. W tym przypadku trastuzumab(CypK)2 wyraża się po prostu przez dodanie CypK 5 mM do pożywki ekspresyjnej.
- Oczyść przeciwciało
- Odwirowywać komórki przez 15 minut przy 3000 x g.
- Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 lub 0,22 μm. Jeśli filtr zostanie zasłonięty, wymień go na nowy i kontynuuj filtrowanie. Jeśli zdarzy się to już po kilku mililitrach, odwiruj supernatant przez dodatkowe 15 minut przy 7000 x g.
- Dodać żywicę białkową A (2 ml/100 ml supernatantu) do pustej kolumny do chromatografii polipropylenowej i zrównoważyć żywicę z co najmniej 5 objętościami buforu do przemywania kulek (0,1 M fosforanu sodu, 150 mM NaCl).
- Podzielić supernatant na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml i dodać 5x bufor do płukania kulek (0,5 M fosforan sodu, 150 mM NaCl), a następnie wstępnie zrównoważoną żywicę białkową A. Umieścić stożkową rurkę na wałku na 3 godziny w temperaturze pokojowej, aby ściągnąć przeciwciało w supernatant.
- Alternatywnie: Dodać supernatant na kolumnę z co najmniej dwukrotnie większą objętością żywicy niż zalecana i pozostawić do przepłynięcia. Upewnij się, że w supernatancie nie pozostała znaczna ilość przeciwciał za pomocą SDS-PAGE. Jeśli tak, należy ponownie wymyć supernatant przez żywicę.
- Przenieś żywicę białka A z supernatantem do kolumny i pozwól cieczy przepłynąć.
- Dodać 25 ml buforu do przemywania (lub co najmniej 10 objętości żywicy) i pozostawić do przepłynięcia.
- Eluować przeciwciało za pomocą 4 ml 0,1 M cytrynianu sodu o pH 3 na 1 ml 1 M buforu fosforanowego, 150 mM NaCl.
- Rozcieńczyć przeciwciało 10 ml PBS, stężyć do 0,5-1 ml przez filtrację odśrodkową i trzykrotnie wymienić bufor z PBS.
- Oczyść próbki za pomocą FPLC przy użyciu butylowej kolumny HIC o przepływie 0,5 ml/min i nachyleniu 0-100% w ciągu 30 minut buforu o niskiej zawartości soli (50 mM fosforan sodu o pH 7,0, 20% izopropanol) w buforze o wysokiej zawartości soli (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM fosforan sodu o pH 7,0, 5% izopropanolu). Zebrać wszystkie frakcje i monitorować elucję przy długości fali 280 nm. Niewielkie ilości (< 1 mg) mogą być oczyszczane za pomocą HPLC-HIC w warunkach opisanych w ppkt 2.4 w celu maksymalizacji wydajności i czystości.
- Zebrać frakcje zawierające przeciwciała, rozcieńczyć je do co najmniej 4 ml za pomocą PBS, zagęścić przez filtrację odśrodkową i trzykrotnie wymienić bufor z PBS.
- Ilościowe określenie przeciwciała
- Uzyskać przybliżone stężenie, mierząc absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
- Jeśli wymagany jest dokładny pomiar, użyj zestawu ELISA do pomiaru ludzkich IgG. Aby uzyskać przybliżoną wycenę, użyj SDS-PAGE z plamą na bazie Coomassie w następujący sposób:
- Przygotować wzorce, rozcieńczając sześciokrotnie dwukrotnie wzorzec trastuzumabu oznaczony ilościowo metodą ELISA w dawce 1 mg/ml.
- Zagotować wzorce i próbki w stężeniu około 0,25 mg/ml w buforze redukującym.
- Uruchom je w 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE za pomocą bufora MES-SDS i zabarwij barwnikiem na bazie Coomassie. Na koniec zmierz gęstość koloru pasma odpowiadającego łańcuchowi lekkiemu lub ciężkiemu za pomocą ImageJ i interpoluj sygnał z próbek w krzywej standardowej.
- Przechowywać przeciwciało w temperaturze 4 °C.
2. Sprzęgnij przeciwciało i scharakteryzuj ADC
- Sprzęgnij przeciwciało z cząsteczką zawierającą tetrazynę
- Rozcieńczyć 10 równoważników molowych tetrazyny-vcMMAE (4 μl, 3,4 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO)) 20 μl acetonitrylu i 76 μl PBS w małej stożkowej probówce (np. probówce do PCR).
- Dodać 1 molowy odpowiednik trastuzumabu(CypK)2 (100 μL, 2 mg/ml w PBS), dokładnie wymieszać i pozostawić do reakcji przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (25 °C) do wytworzenia trastuzumabu(MMAE)2,
nuta: Inne cząsteczki, takie jak tetrazyna-5-TAMRA, mogą być połączone z przeciwciałem zamiast tetrazyny-vcMMAE przy użyciu tego protokołu.
- Oczyść ADC
- Wstępnie zrównoważyć kolumnę wirową wykluczającą rozmiar z PBS zgodnie z instrukcjami producenta.
- Dodać całą objętość reakcji na wirową kolumnę i odwirować przy 1500 x g przez 1 min.
- Określ ilościowo ADC i przeanalizuj koniugat za pomocą SDS-PAGE
- Określić ilościowo ADC zgodnie z opisem w ppkt 1.3.2, mierząc gęstość barwy łańcucha świetlnego na SDS-PAGE przy użyciu niezmodyfikowanego przeciwciała dla krzywej wzorcowej.
- Ciężki łańcuch powinien się nieznacznie przesunąć, wykazując wzrost masy cząsteczkowej po koniugacji.
Uwaga: Jeśli przeciwciało jest modyfikowane fluoroforem, takim jak w trastuzumabie (TAMRA) 2, tylko pasmo odpowiadające łańcuchowi ciężkiemu powinno wykazywać fluorescencję w żelu przed barwieniem.
- Analizuj sprzęgany za pomocą HPLC-HIC
- Równoważyć kolumnę HPLC-HIC ze 100% buforem A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM fosforan sodu pH 7,0, 5% izopropanol) przez 5 minut.
- Zmieszać 15 μl (67 pmol) roztworu trastuzumabu (CypK) o stężeniu 1 mg/ml2 z 15 μl 2 buforu A w fiolce. Następnie zaprogramować wstrzyknięcie 10 μl w HPLC.
- Eluować w izokratycznym przepływie 1 ml / min ze 100% buforem A przez 1 minutę, a następnie 15 minutowy gradient od 100 do 0% buforu A w B (50 mM fosforan sodu o pH 7,0, 20% izopropanol). Monitorować elucję przy długości fali 280 nm.
- Obliczyć DAR, całkując pik odpowiadający każdemu gatunkowi i wykorzystując otrzymane obszary w następującym równaniu:
DAR = (1x trastuzumab(MMAE) + 2x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
Przewidywany czas retencji dla trastuzumabu(CypK)2 wynosi 7,5-8,0 min, dla trastuzumabu(CypK, MMAE) 9,1-9,6 min, a dla trastuzumabu(MMAE)2 wynosi 10,5-11,0 min.