Chromatografia wykluczająca wielkość z detekcją fluorescencji: technika identyfikacji integralności fluorescencyjnych białek błonowych po rozpuszczaniu detergentu

Streszczenie

Źródło: Bird, L. E., et al. Badania przesiewowe białek błonowych w Escherichia coli oparte na zielonym fluorescencyjnym białku. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii z wykrywaniem fluorescencji i wykluczenia wielkości w celu sprawdzenia stabilności białka błonowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w Escherichia coli po solubilizacji detergentu. Białka wykazujące symetryczny pik w profilu wykluczenia wielkości z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnej GFP wskazują na oczyszczone białka z minimalną degradacją i agregacją, które można następnie wybrać do analizy struktura-funkcja.

Protokół

1.Solubilizacja i analiza frakcji membranowej

1. Rozmrozić frakcję membranową (jeśli to konieczne) i dla każdego detergentu, który ma być użyty do rozpuszczania, podamy 900 μl zawiesiny membranowej do probówki do mikrowirówki polialomerowej o pojemności 1,5 ml.
2. Dodać 100 μl każdego świeżo przygotowanego detergentu (10% w/v roztwory DDM, DM, Cymal-6 i LDAO) do końcowego stężenia 1% do podanej probówki o pojemności 1,5 ml. W celu rozpuszczania eukariotycznych białek błonowych do detergentów można dodać hemibursztynian cholesterolu (0,2% stężenia końcowego).
3. Inkubować mieszaniny w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z łagodnym mieszaniem.
4. Frakcję nierozpuszczalną w detergencie osadnić za pomocą ultrawirówki stołowej, upewniając się, że probówki są co najmniej do połowy wypełnione, w temperaturze 150 000 g w temperaturze 4 °C przez 45 minut i zachowując supernatant.
   nuta: Skuteczność solubilizacji detergentu można oszacować za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, mierząc fluorescencję GFP rozpuszczonych membran z frakcją nierozpuszczalną w detergencie zawieszoną w tej samej objętości PBS.
5. Przeanalizuj monodyspersyjność różnych detergentów: kompleksów białek błonowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości wykrywanej przez fluorescencję (FSEC).
6. Do analizy FSEC należy zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość o szerokim zakresie frakcjonowania, np. od 5 000 do 5 000 000 masy cząsteczkowej, z buforem bieżącym (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min. Należy użyć tego buforu dla wszystkich próbek, tj. nie jest on zmieniany dla każdego testowanego detergentu.
7. Wstrzyknąć 100 μl rozpuszczonych membran do kolumny z natężeniem przepływu 0,3 ml/min. Monitorować profil elucji za pomocą optyki fluorescencyjnej (wzbudzenie przy 488 nm i emisja przy 512 nm). Jeśli wbudowany monitor fluorescencji nie jest dostępny, zbierz frakcje i odczytaj fluorescencję w czytniku płytek.
8. Importuj dane dotyczące objętości elucji i intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego w celu wyświetlenia graficznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hemibursztynian cholesterolu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C6512
CYMAL-6 (6-cykloheksylo-1-heksylo-βD-maltozyd)	Anatrace (Ślad anatrace	Zobacz materiał C326
DDM (n-dodecyl β-maltozyd)	Generon	Zobacz materiał D97002
DM (n-decyl β-maltozyd)	Generon	Zobacz materiał D99003
LDAO (N,N-tlenek dimetylo-ndodecyloaminy)	Generon	Zobacz materiał D71111
BenchMark Fluorescencyjny wzorzec białka	Technologie życiowe	LC5928
Optima L-100 Ultrawirówka z wirnikiem 45-Ti	Beckman Coulter	393253
Ultrawirówka Optima Max-XP z wirnikiem TLA-55	Beckman Coulter	393315
Ekscelencja UFLC z detektorem fluorescencji RF-20A	Shimadzu powiedział:
Sepharose 6 Kolumna wykluczająca rozmiar 10/300 GL	GE Opieka zdrowotna	Numer katalogowy: 17-5172-01