Chromatografia powinowactwa oparta na DFE: technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych 2F5 z surowej próbki przy użyciu warunków elucji opartych na wysokiej sile jonowej

Abstract

Źródło: Knödler, M. et al., Aktywowana agaroza usieciowana w celu szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych powinowactwa - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje technikę chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych 2F5 za pomocą ligandów DsRed-2F5-Epitope lub DFE. Oczyszczone przeciwciała monoklonalne 2F5 są niezbędnymi lekami w immunoterapii.

Protocol

1. Testowanie oczyszczania mAb z ekstraktów z roślin klarowanych

1. Przygotować 100 ml oczyszczonego ekstraktu roślinnego zawierającego 2F55 lub supernatant z preferowanego komórkowego systemu ekspresji, również zawierającego 2F5.
2. Przygotować bufor równowagowy (20 mM fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu, pH 7,4), bufor elucyjny o niskim pH (0,05 M cytrynian, 0,05 M chlorek sodu, pH 4,0–3,25) i bufor elucyjny o wysokiej sile jonowej (1,0–4,0 M chlorek magnezu, 0,1 M HEPES, pH 8,0)
3. Przepłukać system chromatograficzny. Zamontować kolumnę powinowactwa DFE (patrz tekst głównego protokołu) w systemie chromatograficznym i zrównoważyć z 5 CV buforu równowagi przy natężeniu przepływu 1,0 ml ^min-1. Monitorować absorbancję promieniowania UV przy 280 nm.
   nuta: Ładowanie ekstraktu roślinnego lub supernatantu z kultur komórkowych do kolumny może spowodować wzrost ciśnienia wstecznego. Ustawić alarm wysokiego ciśnienia na 0,2 MPa, aby uniknąć uszkodzenia systemu chromatograficznego lub kolumny DFE.
4. Załadować 80 ml oczyszczonego ekstraktu roślinnego lub supernatantu (krok 1.1) na kolumnę z natężeniem przepływu 0,5 ml min-1, aby zagwarantować czas kontaktu wynoszący 2 minuty. Zebrać próbki przepływowe we frakcjach o objętości 2 ml w celu rekonstrukcji krzywej przełomu. Przechowywać próbki przepływowe w temperaturze 4 °C, jeżeli natychmiastowa analiza próbki nie jest możliwa
.
5. Przemyć kolumnę buforem równowagowym o stężeniu 6 CV. Zbierz próbkę prania na początku, w środku i na końcu tego kroku.
6. Elutę mAb 2F5 za pomocą 5 CV buforu elucyjnego o niskim pH lub buforu elucyjnego o wysokiej sile jonowej (0,1 M HEPES, 1,25 M chlorek magnezu, pH 8,0). Zbierz frakcję DFE, gdy sygnał UV 280 nm wzrośnie do 5 mAU powyżej linii podstawowej.
   1. Zoptymalizuj bufor elucyjny dla każdej pary epitop-przeciwciało. W przypadku 2F5 1,25 M chlorek magnezu osiągnął optymalną równowagę między odzyskiem produktu a stabilnością liganda.
      nuta: Roztwór chlorku magnezu jest podatny na wytrącanie się. Dlatego rozpuść chlorek magnezu w ~700 ml wody. Oddzielnie rozpuść HEPES w 100 ml wody i dostosuj pH do 8,0. Dodać rozpuszczony roztwór chlorku magnezu do roztworu HEPES i dodać wodę do końcowej objętości 1,0 l. Nie należy regulować pH po rozpuszczeniu chlorku magnezu, ponieważ spowoduje to wytrącanie się.
7. Przeanalizować wszystkie próbki pobrane w krokach 1.4–1.6 przy użyciu metody Bradforda, elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylu siarczanu litu (LDSPAGE) i spektroskopii powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsRed (Czerwony)	Edytor IME Fraunhofe	N/a	Standardy
HiTrap Sepharose HP aktywowana przez NHS, 1 ml	GE Helthcare	Numer katalogowy: 17-0716-01	Kolumny chromatograficzne
HEPESY	Carl Roth GmbH	9105.3	Składnik bufora
Chlorek magnezu	Carl Roth GmbH	Zobacz materiał KK36.2	Składnik bufora
PH 3110	WTW	Zobacz materiał 2AA110	pH-metr
Sephadex G-25 drobny, usieciowany dekstran	GE Helthcare	17003301	Żywica chromatograficzna
chlorek sodu	Carl Roth GmbH	Zobacz materiał P029.2	Składnik bufora
Cytrynian sodu	Carl Roth GmbH	Zobacz materiał HN13.2	Składnik bufora