Artykuł metodologiczny

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Pokhrel, A., et al. A Oczyszczanie i test aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Test aktywności białek metodą chromatografii cienkowarstwowej

  1. Przygotować płytkę do chromatografii cienkowarstwowej (TLC).
    1. Przygotuj płytki z polietylenu etylenoiminy (PEI) i celulozy, myjąc je w wodzie dejonizowanej. Umieść płytki w szklanej komorze z podwójnie destylowaną wodą na głębokość ~0,5 cm.
    2. Pozwól, aby woda przeniosła się na wierzch talerza.
      UWAGA: Mycie płyt nie jest bezwzględnie konieczne, ponieważ płyty mogą być używane bez niego, ale mycie zwiększa klarowność uzyskanych obrazów. Mycie płytek w dwóch prostopadłych kierunkach dodatkowo zapewnia, że wszelkie zanieczyszczenia obecne w żywicy są izolowane w jednym rogu płytki (rysunek 1).
    3. Wyjmij talerze ze szklanej komory i pozostaw na półce do wyschnięcia na noc (12–18 godzin).
    4. Oznacz suche płytki w odległości 2,0 cm od jednej krawędzi miękkim ołówkiem, aby wskazać, gdzie próbki zostaną zastosowane do TLC. W przypadku próbek o objętości 2 μl należy nanosić próbki w odległości nie mniejszej niż 1,0 cm od siebie (rysunek 1).
      UWAGA: Pozwala to na wyraźną separację między sąsiednimi punktami, co ma kluczowe znaczenie dla kwantyfikacji sygnału. Dopóki żywica celulozowa nie zostanie porysowana, małe ślady ołówka na powierzchni nie będą przeszkadzać w migracji rozpuszczalnika.
    5. Planując eksperymenty, zawsze zostawiaj jedno miejsce na każdej talerzu niewykorzystane.
      UWAGA: Zapewni to puste pole do oznaczania ilościowego próbki (rysunek 1). Na talerzu TLC o średnicy 20 cm znajdzie się miejsce na 19 miejsc.
  2. Oznaczenie aktywności enzymatycznej
    1. Przygotować 5-krotną mieszaninę buforową zawierającą 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM octanu amonu, 10 mM KCl, 1 mM DTT i 0,6 mM ATP (trifosforan adenozyny).
      UWAGA: Mieszanina ta może być przygotowywana w dużych ilościach i zamrażana w podwielokrotnościach o pojemności 10 μl do późniejszego wykorzystania. Nie poddawaj mieszanki wielu cyklom zamrażania i rozmrażania.
    2. Przygotować indywidualne reakcje zawierające 3 μM RSH (enzymy homologiczne Rel/Spo), 1x mieszanina buforowa, 0,6 mM GDP (difosforan guanozyny), 1,2 mM MgCl2. Dodać 1,0 μCi γ-32P-ATP (znakowanego radioizotopem) na 10 μl reakcji i użyć wody wolnej od nukleaz, aby doprowadzić reakcję do pożądanej objętości. Dodać RSH po wymieszaniu pozostałych składników, ponieważ dodanie RSH do mieszaniny zawierającej nukleotydy inicjuje test aktywności enzymatycznej.
      UWAGA: Ostateczna objętość reakcji będzie zależeć od liczby punktów czasowych, w których pobrano próbki. Aby pobrać próbkę 2 μl/punkt czasowy, należy zebrać 10 μl mieszaniny reakcyjnej na każde 4 punkty czasowe.
    3. Aby kontrolować hydrolizę ATP z zanieczyszczającej aktywności nukleazy, należy zebrać 10 μl reakcji niezawierającej białka i inkubować ją równolegle. Umieścić 2 μl próbek przy t = 0 i na końcu doświadczenia, aby upewnić się, że ATP nie uległo hydrolizie pod nieobecność białka.
    4. Natychmiast po dodaniu RSH usunąć 2 μl i umieścić je na oznakowanej płytce celulozowej PEI jako próbkę t = 0 min.
    5. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C, usuwając 2 μl podwielokrotności w żądanych punktach czasowych.
      UWAGA: Aktywność enzymatyczna ustanie, gdy próbka zostanie zaadsorbowana na płytce celulozowej. Odczekaj 10–30 minut po dodaniu ostatniego plamki do płytki przed wywołaniem, aby zapewnić pełną adsorpcję i wysuszenie próbki.
  3. Chromatografia cienkowarstwowa
    1. Napełnić komorę chromatograficzną 1,5 M 1,5 M KH2PO4 (pH 3,64) na głębokość 0,5 cm.
      UWAGA: Wymagana objętość będzie zależeć od wymiarów zbiornika chromatograficznego. Każdy szklany pojemnik z równym dnem, które jest wystarczająco szerokie, aby umożliwić włożenie płytki TLC bez zginania, może być używany jako zbiornik do wywoływania z dodatkiem pokrywy. Płytkę TLC można pociąć na węższe paski za pomocą czystej żyletki, aby umożliwić rozwój w szklanej zlewce pokrytej folią z tworzywa sztucznego.
    2. Zanurz dolną krawędź płytki w rozpuszczalniku. Pozwól rozpuszczalnikowi migrować do górnej części płytki (~90 min).
      UWAGA: Podczas gdy migracja rozpuszczalnika zatrzyma się na górze płytki, a próbki nie zostaną utracone ani nie będą spływać razem podczas dłuższego zanurzenia, płytek nie należy pozostawiać na noc w rozpuszczalniku. Zanurzenia dłuższe niż 4 godziny mogą spowodować oderwanie się żywicy od podłoża płyty i spowodować utratę sygnału.
    3. Wyjąć płytkę ze zbiornika chromatograficznego i umieścić ją na stojaku do suszenia na stole.
    4. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez noc.
      UWAGA: Suszenie można przyspieszyć za pomocą suszarki do włosów. Suchość można ocenić na podstawie koloru żywicy, która ciemnieje, gdy jest mokra i powraca do koloru nieużywanej płytki po całkowitym wyschnięciu.
    5. Po wyschnięciu płytki owinąć ją folią z tworzywa sztucznego, aby uniknąć przeniesienia materiału radioaktywnego do kasety obrazowej i przeanalizować za pomocą autoradiografii (ryc. 2).
  4. analiza danych
    1. Płytkę celulozową PEI zawierającą rozdzielone reakcje należy wystawić na działanie kasety z fosforem przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Jest to wystarczająca ekspozycja, aby uzyskać bardzo wyraźny obraz przy użyciu wskazanych stężeń świeżego γ-32P-ATP. W przypadku użycia mniejszej ilości substratu znakowanego radioizotopem czas ekspozycji można wydłużyć do 12-16 godzin.
    2. Zobrazuj kasetę na luminowizorze.
    3. Korzystając z oprogramowania do obrazowania z graficznym interfejsem użytkownika, narysuj obszary zainteresowania (ROI), wybierając opcję Rysuj prostokąt i używając myszy, aby narysować prostokątne ROI wokół jednego całego pasa oraz miejsca ATP i ppGpp (tetrafosforan guanozyny) znajdujące się w tym pasie (rysunek 2).
    4. Użyj poleceń Wybierz, Kopiuj i Wklej (lub odpowiednich poleceń w zależności od używanego oprogramowania do obrazowania), aby narysować identyczne ROI na innych torach, aby upewnić się, że ROI mierzą sygnał w identycznych obszarach na każdym pasie. Uwzględnij ROI z nieużywanego toru, które mają być używane jako puste miejsca.
    5. Korzystanie z punktu menu Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji | Dodaj polecenia oprogramowania do obrazowania, wybierz wszystkie ROI narysowane na płycie celulozowej PEI.
    6. Korzystanie z punktu menu Analizuj | Ustawianie pomiarów | Zmierz polecenia, określ ilościowo natężenie sygnału w ramach każdego zwrotu z inwestycji i wyeksportuj pomiary jako arkusz kalkulacyjny (rysunek 2). Odejmij puste wartości ROI od sygnałów eksperymentalnych.
      figure-protocol-1
    7. Oblicz, jaki procent wygaszonego sygnału na każdym pasie można przypisać ATP i ppGpp, korzystając ze wzorów.
      UWAGA: ROI można narysować i określić ilościowo za pomocą komercyjnego oprogramowania kompatybilnego z phosphorimager lub ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie płytek TLC. (A) Płytki myje się w jednym wymiarze poprzez umieszczenie dolnej krawędzi w wodzie (kolor niebieski). Zanieczyszczenia (kolor żółty) migrują wraz z rozpuszczalnikiem na wierzch płytki. (B) Po całkowitym wysuszeniu płytki, jest ona myta w drugim wymiarze, obracając ją o 90° w stosunku do pierwszego prania i ponownie pozwalając wodzie migrować do górnej części płytk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zbiornik rozwojowy do chromatografu cienkowarstwowego (TLC)Ogólna firma zajmująca się szkła80-3 Rozdział 80-3
Płyty polietylenowe (PEI) celulozowe (20 cm x 20 cm, grubość 100 μm) z podparciem poliestrowymSigma-AldrichZ122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml ołów, 100 μCiPerkin ElmerNEG002A
5'-trifosforan adenozyny (ATP) 100 mMBio Podstawowy KanadaAB0311
Sól disodowa guanozyno-5'-difosforanu (GDP)Alfa AesarAAJ61646MC/E
Ekran luminoforowy do przechowywaniaGE Healthcare Nauki przyrodniczeEkran trytowy BAS-IP TR 2040 E
Luminowizator Storm 860GE Healthcare Nauki przyrodnicze-
powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Thin Layer ChromatographyEnzyme Activity AssayPyrophosphokinase ActivityRadiolabeled ATPGuanosine TetraphosphatePEI Cellulose PlateAutoradiography AnalysisPhosphorimager ImagingReaction Mixture PreparationTime Point Sampling

Powiązane artykuły