1. Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC) do półilościowego określenia ilości kilku lipidów, w tym cholesterolu, fosfolipidów i sfingomieliny
- Przygotuj następujące cztery roztwory bieżące i roztwory barwiące.
- Roztwór 1: Wymieszaj octan etylu (26,6%), 1-propanol (26,6%), chloroform (26,6%), metanol (26,6%) i chlorek potasu (9,6%). Przygotować KCl, rozpuszczając 0,25 g KCl w 100 ml wody o jakości HPLC.
- Rozwiązanie 2: Wymieszaj n-heksan (73%), eter dietylowy (23%) i kwas cytrynowy (2%).
- Rozwiązanie 3: 100% n-heksanu.
- Przygotuj roztwór barwiący, mieszając wodę destylowaną (90 ml) z 7,5 g siarczanu miedzi, a następnie dodaj 10 ml kwasu fosforowego.
- Napełnij do 5 mm każdego roztworu w oddzielnej szklanej komorze. Dodaj dowolny rodzaj bibuły filtracyjnej, aby zwiększyć prędkość pracy w każdej komorze.
- Wstępnie inkubować szklaną płytkę o wymiarach 20 x 10 cm z żelem krzemionkowym HPTLC 60 w pierwszym roztworze do biegania, aż roztwór do biegania dotrze do górnej części płytki. Następnie suszyć przez 10 minut w temperaturze 110 °C.
nuta: Płytki te można przechowywać do wykorzystania w przyszłości w folii aluminiowej i suszyć przez 10 minut w temperaturze 110 °C przed użyciem.
- Rozpuścić osad lipidowy otrzymany z neutrofili pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej w 200 μl roztworu chloroformu/metanolu (1:1) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C do rozpuszczenia.
- Użyj linijki i miękkiego ołówka, aby zaznaczyć miejsca załadunku dla żądanej liczby próbek oraz co najmniej jednego wzorca. Oznacz dystans biegu na około 4 cm i 6 cm odpowiednio dla pierwszego i drugiego roztworu do biegania.
- Aby załadować próbki, przed załadowaniem każdej nowej próbki należy umyć strzykawkę o pojemności 10 μl 3 razy w chloroformie/metanolu (1:1). Załadować kroplami 10 μl każdej próbki, starając się skoncentrować próbkę na jak najmniejszym obszarze. Próbki powinny być ładowane co najmniej w dwóch egzemplarzach.
- Umieść płytkę pionowo w pierwszej komorze z roztworem bieżącym 1 (krok 1.1.1). Upewnij się, że płytka jest równoległa do ścianki szklanej komory, aby uzyskać równomierną prędkość migracji.
- Gdy linia rozpuszczalnika dotrze do pierwszego znaku, wyjmij płytkę, wysusz ją i umieść w drugim roztworze. Powtórz podobne kroki dla drugiego i trzeciego uruchomionego rozwiązania; pozostawić płytkę w roztworze do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki, a następnie wyjąć ją i wysuszyć w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
- Umieść płytkę w roztworze siarczanu miedzi na 7 s. Wyjmij talerz, dokładnie osusz i piecz w piekarniku przez 7 minut w temperaturze 170 °C. Poczekaj, aż talerz ostygnie.
- Korzystając z oprogramowania do chromatografii cienkowarstwowej i analizy żeli, a także oprogramowania do przetwarzania obrazu, skanuj i analizuj w celu zidentyfikowania rozdzielczych pasm lipidów.
