Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

Streszczenie

Źródło: Fhied, C. L. et al., Dynamiczne monitorowanie serokonwersji przy użyciu wieloanalitowego testu immunobeadowego dla Covid-19. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przygotowanie mikrosfer sprzężonych z antygenem

1. Wybierz trzy różne fiolki z mikrosferami magnetycznymi z unikalnymi obszarami kulek, zapisując identyfikator kulki i informacje o partii dla każdej użytej fiolki.
   nuta: Poniższe kroki zostaną wykonane dla każdego odrębnego regionu mikrosfery. Mikrosfery są wrażliwe na światło i należy je chronić przed długotrwałym działaniem światła. Podczas etapów prania należy uważać, aby nie naruszyć mikrosfer. W przypadku zakłóceń odczekaj drugie 60 sekund separacji.
2. Wiruj mikrosferę przez 60 s i sonikuj przez 5 minut przed użyciem, aby zdysocjować zagregowane kulki.
3. Przenieś 1,0 x 10⁶ kulek do 1,5 ml niskobiałkowych probówek wirówkowych.
4. Włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu kulkowego.
5. Wyjmij probówkę z separatora magnetycznego, ponownie zawieś kulki za pomocą 100 μl wody klasy HPLC i wiruj przez 30 sekund. Umieść probówkę z powrotem w separatorze magnetycznym na 60 s, a następnie usuń supernatant. Powtórz ten protokół prania dwukrotnie.
6. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić umyte mikrosfery w 90 μl 100 mM jednozasadowego fosforanu sodu o pH 6,2 (bufor aktywacyjny) przez wirowanie przez 30 s.
7. Dodać 10 μl 50 mg/ml Sulfo-NHS (rozcieńczonego buforem aktywacyjnym) do mikrosfer i delikatnie wirować przez 10 s. Dodać 10 μl 50 mg/ml roztworu EDC (rozcieńczonego buforem aktywacyjnym) i delikatnie wirować przez 10 s. Inkubować mikrosfery przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym wirem co 10 minut.
8. Powtórz kroki mycia 1,4-1,5 z 50 mM MES, pH 5,0 (bufor sprzęgający) zamiast wody klasy LC/MS, w sumie dwa mycia.
9. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić kulki ze 100 μl buforu sprzęgającego za pomocą wiru przez 30 s, a następnie natychmiast dodać żądaną ilość białka.
10. Doprowadzić całkowitą objętość do 150 μl za pomocą bufora sprzęgającego. Mieszać reakcję sprzęgania wirowego przez 30 s i inkubować przez 2 godziny przez obrót w temperaturze RT.
    nuta: Dla testów zdefiniowanych w niniejszym dokumencie koniugacje przeprowadzono z następującymi stężeniami białek: Spike S1: 5 μg; Nukleokapsyd: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.
11. Powtórz etap płukania 1.4 z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) -1% albuminą surowicy koziej, 0,01% polisorbatem-20 (buforem hartującym) zamiast wody klasy LC/MS, w sumie dwa płukania. Ponownie zawiesić przemyte mikrosfery w 100 μl buforu hartowniczego zawierającego 0,05% azydku sodu wirowo przez 30 s.
    nuta: Pozwól kulkom całkowicie schłodzić się przez co najmniej 6 godzin przed przystąpieniem do jakiejkolwiek innej procedury.
12. Policz liczbę odzyskanych mikrosfer za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Zapisz zaobserwowane stężenie kulek.
13. Sprzężone mikrosfery przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C w ciemności.

2. Procedury

1. Wydajność testu (protokół podstawowy)
   1. Ponownie zawiesić sprzężone mikrosfery za pomocą wiru na 30 s i sonikować przez ~60-90 s.
   2. Usuń wymaganą ilość koloidu z każdego koloidu kulek z odpowiedniej probówki i połącz koloidy kulek w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   3. Włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu kulkowego.
   4. Usunąć kulki z separatora, ponownie zawiesić je ze 100 μl PBS-1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,01% polisorbatu-20 (bufor testowy) i wirować przez 30 s. Umieścić probówkę w separatorze magnetycznym i pozostawić separację na 60 s. Powtórzyć ten protokół mycia (tj. kroki 2.1.3-2.1.4) dwukrotnie.
   5. Dostosuj stężenie mieszaniny mikrosfer roboczych 3-plex, dodając odpowiednią objętość buforu testowego, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mikrosfer na 1 μl dla każdego celu.
   6. Podwielokrotność 12,5 μl mieszaniny mikrosfer przygotowanej w kroku 2.1.5 do każdego dołka płytki 384-dołkowej lub 25 μl do każdej studzienki płytki 96-dołkowej.
   7. Rozcieńczyć próbki osocza/surowicy 500-krotnie w buforze testowym. Przygotować próbki wzorcowe zgodnie z pożądanym miareczkowaniem.
   8. Dodać 12,5 μl buforu do oznaczania jako próbkę ślepą i dodać każdą z rozcieńczonych próbek lub wzorców do każdego wyznaczonego dołka na 384-dołkowej płytce do pobierania próbek lub 25 μl ślepej, rozcieńczonej próbki lub wzorca do każdego dołka na 96-dołkowej płytce do pobierania próbek.
   9. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze suchej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min.
      nuta: Schemat krzywych rozcieńczania znajduje się w tabeli 1.
   10. Przygotować roztwór przeciwciał wykrywających przeciwciała anty-ludzkie (roztwory przeciwciał drugorzędowych) w stężeniu 4 μg/ml z buforem testowym, jak określono w kroku 2.1.11.
   11. Przygotować przeciwciała przeciwko ludzkim IgM, sprzężone z przeciwciałami Super Bright 436 (SB)/Koziołkowo-anty-ludzkimi IgA, fikoerytryną (PE) w sile 4 μg/ml; lub kozio-anty-ludzkie IgM, SB Sprzężone / Kozio-anty-ludzkie, PE Sprzężone przeciwciała wykrywające w 4 μg/ml.
       nuta: W przypadku formy płytki 384-dołkowej wymagane jest 12,5 μl/basenik przygotowanego roztworu przeciwciał drugorzędowych, a w przypadku formatu płytki 96-dołkowej wymagane jest 25 μl/basenik.
   12. Umieść płytkę na separatorze magnetycznym, szybko umyj i mocno odwróć nad pojemnikiem na zagrożenie biologiczne, aby usunąć płyn ze studni. Trzymając talerz nadal odwrócony, mocno uderz nim o gruby zwitek papieru.
   13. Przemyć każdą studzienkę 100 μl buforu do oznaczania i usunąć ciecz przez wymuszoną inwersję nad pojemnikiem stanowiącym zagrożenie biologiczne, jak opisano wcześniej. Powtórz te kroki (2.1.12-2.1.13), co daje w sumie dwa prania. Wyrzuć wszystkie zużyte zwitki papieru do pojemnika na zagrożenie biologiczne.
   14. Dodać 12,5 μl roztworu roboczego przeciwciała wtórnego do każdego dołka płytki 384-dołkowej lub 25 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min.
   15. Powtórz kroki prania 2.1.12-2.1.13.
   16. Dodać 75 μl buforu testowego do każdego dołka płytki 384-dołkowej lub 100 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 5 minut w temperaturze suchej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min.
   17. Analizuj 60 μl za pomocą analizatora przyrządów zgodnie z instrukcją obsługi systemu.

Tabela 1: Seria rozcieńczeń dla krzywych standardowych: Tabela współczynników rozcieńczenia użytych dla krzywych standardowych dla serotypu IgG; przedstawiona jako 7-punktowa, seryjna krzywa rozcieńczania 1:5 zaczynająca się od 1 μg/ml dla α-Spike S1 i α-Nucleocapsid oraz 5 μg/ml dla przeciwciał α-Membrane.

pkt. pkt.

Numer standardowy	Seria rozcieńczeń	Anty-Spike S1 lub N (μg/ml)	Powłoka antymembranowa (μg/ml)
pusty	pusty	-	-
1	Układ łożyska STD7 1:1	1	5
cyfra arabska	Łożysko STD6 1:5	0,2	1
3	Choroba St5 1:25	0,04	0,2
4	Choroba przenoszona drogą piersiową 4 1:125	0,008	0,04
5	Choroba przenoszona drogą płciową 3 1:625	0,0016	0,008
6	Choroba przenoszona drogą płciową 2 1:3125	0,00032	0,0016
7	Choroba przenoszona drogą płciową 1:15625	0,000064	0,00032

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
384-dołkowe czarne boczne płytki do mikromiareczkowania z polistyrenu	Rybak termiczny	12-565-346
Bufor aktywacyjny (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)	Przygotowane na miejscu
Bufor do oznaczania (PBS, 1% albumina surowicy bydlęcej, 0,01% polisorbat-20)	Przygotowane na miejscu
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja szoku cieplnego	MiliporeSigma	A-7888-50G
Bufor sprzęgający (50 mM MES, pH 5,0)	Przygotowane na miejscu
COVID 19 M Coronavirus Rekombinowane białko macierzy (6xHistag)	MyBioSource (Źródło MyBioSource	MBS8574735
Jednorazowe końcówki do pipet
EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu)	Rybak termiczny	PIA35391
Albumina kozia, frakcja V w proszku	Millipore Sigma	A2514-1G
Koza IgA anty-ludzka, R-PE, Polyclona	Rybak termiczny	OB205009
IgG Koza anty-ludzka, R-PE, poliklonalna	Rybak termiczny	OB204009
IgG Koza anty-królicza, R-PE, poliklonalny	Rybak termiczny	OB403009
gM Koza anty-ludzka, R-PE, poliklonalna	Rybak termiczny	OB202009
Mysz IgM anty-ludzka, SB 436, klon SA-DA4	Rybak termiczny	62999842
Analizator przyrządów	Luminex Sp. z o.o.	INTELLIFLEX-RUO
Probówki wirówkowe do mikrowirówek o niskiej zawartości wiązania (1,5 ml)	Rybak termiczny	13-698-794
Mikrosfery MagPlex-C, Region XXX	Luminex Sp. z o.o.	MC10XXX-01
Hydrat MES (hydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego)	MiliporeSigma	Zobacz materiał M2933
Aluminiowa taśma uszczelniająca do mikropłytek	Rybak termiczny	07-200-683
Polisorbat-20	Rybak termiczny	Zobacz materiał BP337-500
Quality Biological Inc. PBS, pH 7,2	Rybak termiczny	Tel. katalogowy: 50-751-7328
Bufor gaszący (PBS, 1% albumina surowicy koziej, 0,01% polisorbat-20)	Przygotowane na miejscu
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Białko nukleokapsydu (jego tag)	Preparaty biologiczne Sino	40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Białko kolca (podjednostka S1, jego tag)	Preparaty biologiczne Sino	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD przeciwciało, królicze pAb	Preparaty biologiczne Sino	Numer katalogowy: 40592-T62
Przeciwciało nukleokapsydu SARS-CoV-2 (2019-nCoV), mAb królika	Preparaty biologiczne Sino	40588-R0004
Przeciwciało błonowe (IN) przeciwko SARS-CoV-2 (COVID-19), pAb królika	Profesjonaliści	10-516
Sulfo-NHS (N-hydroksysulfosukcynimid)	Rybak termiczny	PIA39269
Bufor do przemywania (PBS, 0.01% polisorbat-20)	Przygotowane na miejscu
Woda, klasa LC/MS	Rybak termiczny	W-64

)