Test aktywności fosfolipazy: Test dyfuzji żelu w celu określenia aktywności fosfolipazy w surowym ekstrakcie jadu z Anthopleura dowii

Streszczenie

Źródło: Ramírez-Carreto, S., et al., Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów za pomocą prostych testów biologicznych. J. Vis. Exp. (2022)

W tym filmie demonstrujemy test pozwalający ustalić obecność fosfolipazy w surowym ekstrakcie z jadu Anthopleura dowii - morskiego ukwiału. Test wykorzystuje technikę dyfuzji żelu agarozowego, w której enzym fosfolipaza dyfunduje i rozkłada fosfolipidy zawarte w pożywce stałej w sposób promienisty.

Protokół

1. Kolekcja organizmów

1. Zbierz ukwiał A. dowii.
   UWAGA: Tutaj organizmy zostały zebrane podczas okresów odpływu w strefie międzypływowej u wybrzeży Ensenada Baja w Kalifornii, Meksyku (Rysunek 1A, B). 
2. Organizmy należy przetransportować do laboratorium w pojemnikach z wodą morską (ryc. 1C).
3. W laboratorium należy ręcznie oczyścić organizmy wodą destylowaną, aby usunąć duże cząsteczki substratu przylegające do ciała.
4. Organizmy należy natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C w ultrazamrażarce przez 72 godziny.
5. Umieść organizmy w specjalnych szklankach do liofilizacji, w warunkach liofilizacji -20 °C, 0,015 psi, przez 48 godzin.
6. Organizmy liofilizowane przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

2. Nawodnienie tkanek

1. Rozpuścić 20 g suchej masy organizmów liofilizowanych w 60 ml (1/3 w/v) 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,5 i 1 tabletce koktajlu inhibitorów (tabela materiałów).
2. W mieszadle magnetycznym ciągle mieszać próbkę z prędkością ~800 obr./min, 4 °C, przez 12 godzin.

3. Uwalnianie toksyn

1. Aby wywołać lizę komórek i wydzielanie nematocyst, należy zamrozić próbkę w temperaturze -20 °C przez 12 godzin, a następnie umieścić pojemnik w wodzie o temperaturze pokojowej (RT), aż rozmrozi się do 90%. Powtórz tę procedurę trzy razy.
   nuta: Próbka nie rozmraża się w 100%; bardzo ważne jest utrzymanie próbki w temperaturze ~4 °C, aby zapobiec degradacji białek.
2. Obserwuj nematocystę wydzieloną pod mikroskopem konfokalnym. Pobrać 10 μl próbki na szkiełko podstawowe i nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe. Obserwuj pod mikroskopem konfokalnym przy powiększeniu 100x i 60x. Tutaj barwnik nie był potrzebny.
3. Przetwarzaj obrazy zarejestrowane w mikroskopie konfokalnym w oprogramowaniu ImageJ (wersja 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).
4. Jeśli kanalik wewnątrz nematocysty rozwija się i znajduje się na zewnątrz, nematocysty są rozładowywane; następnie przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie przeprowadź jeszcze tylko jeden cykl zamrażania i rozmrażania.
5. W celu sklarowania ekstraktu odwirować próbkę o masie 25 400 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C, odzyskać supernatant i ponownie go odwirować. Powtórz ten krok 3-4 razy.
6. Odzyskać supernatant i wyrzucić osad. Supernatant lub surowy ekstrakt zawiera składniki jadu (toksyny) i inne cząsteczki komórkowe, takie jak lipidy, węglowodany i kwasy nukleinowe.

4. Oznaczanie ilościowe białka ogółem

1. Określić stężenie białka w surowym ekstrakcie za pomocą komercyjnego zestawu do testów kolorymetrycznych Bradforda (tabela materiałów).
2. Rozcieńczyć odczynnik barwnikowy (jedną część barwnika czterema częściami wody destylowanej).
3. Przygotować roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) frakcji V (tabela materiałów) o stężeniu 1 mg/ml w buforze fosforanowym (50 mM fosforanu sodu, pH 7,5).
4. Przygotować roztwory wymienione w Tabeli 1 w trzech egzemplarzach.
5. Energicznie mieszaj każdy roztwór w shakerze przez 4 sekundy.
6. Próbki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, bez wstrząsania.
7. Zmierzyć absorbancję (AU) przy 595 nm.
8. Wykreślić średnie absorbancji BSA próbki (AU w funkcji stężenia białka) i wyznaczyć równanie wykresu (równanie 1).
   
   gdzie y jest absorbancją, m jest nachyleniem linii, x jest stężeniem białka, a b jest punktem przecięcia z osią y. Aby obliczyć stężenie ekstraktu surowego, rozwiąż dla x w następujący sposób:
   

5. Określ złożoność jadu polipeptydowego

1. Zmontuj szklany pojemnik do pionowej elektroforezy żelowej zgodnie z instrukcją.
2. Przygotuj mieszaninę akryloamidu (30%): 29,2 g akrylamidu, 0,8 g bis-akrylamidu, końcowa objętość 100 ml. Przefiltrować roztwór za pomocą membrany 0,45 μm. Roztwór należy przechowywać w ciemnej butelce w temperaturze 4 °C. Następnie przygotuj mieszaninę na żel rozdzielczy (Tabela 2).
3. Żel SDS-PAGE składa się z żelu rozdzielczego i żelu do układania w stosy. Przygotować żele zgodnie z objętościami roztworu określonymi w Tabeli 2. Podczas przygotowywania należy upewnić się, że każda mieszanina jest utrzymywana w temperaturze 4 °C, aby skrócić czas polimeryzacji.
   nuta: Objętość każdej mieszanki różni się w zależności od marki używanego sprzętu; dla tego protokołu objętości odpowiadają przygotowaniu 15% żelu akrylowego o grubości 0,75 mm do pionowej komory elektroforetycznej (tabela materiałów).
4. Po polimeryzacji akrylamidu, ~10 min, dodać mieszaninę żelu do układania.
5. Przygotuj mieszaninę na żel do układania w stosy, natychmiast dodaj ją do szklanych płytek i umieść grzebień, aby uformować dołki do ładowania próbek.
6. Po polimeryzacji żelu do układania w stosy (~15 min) wyjmij grzebień i umieść szklany pojemnik w komorze do elektroforezy pionowej.
7. Umieścić 200 ml buforu elektrod (0,25 M Tris, 0,192 M glicyny, 0,1% SDS) w komorze elektroforezy.
8. Analiza surowego ekstraktu: Wymieszaj 30 μg surowego ekstraktu z 5 μl buforu ładującego białko (25% glicerolu, 15% dodecylosiarczanu sodu, 25% 2-merkaptoetanolu, 0,125 mM Tris pH 7, błękit bromofenolowy 0,1 mg / ml) w celu denaturacji białek. Ostateczna objętość musi wynosić <50 μl.
9. Podgrzewać w temperaturze 90 °C przez 5 minut, schłodzić i odwirowywać przez 3 sekundy przy 1 400 x g. 10. Załaduj próbki do dołków żelu do układania w stosy. Załaduj standardową drabinę o masie cząsteczkowej.
10. Załadować próbki do dołków żelu do układania w stosy. Załaduj standardową drabinę o masie cząsteczkowej.
11. Uruchomić elektroforezę przy stałym natężeniu 25 mA przez 1 godzinę 30 min.
12. Wyjmij szklane pojemniki z komory elektroforetycznej, aby przystąpić do barwienia białek żelu.

6. Barwienie białek

1. Wypłucz żel w 50 ml wody destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z elektrody buforowej.
2. Wylej wodę.
3. Aby uniknąć dyfuzji białek żelu, dodać roztwór utrwalający (60 ml etanolu, 20 ml kwasu octowego i 20 ml wody destylowanej, końcowa objętość 100 ml). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut z wytrząsaniem przy 80 obr./min. Zdekantować roztwór.
4. Dodać białkowy roztwór sieciujący (15 ml etanolu, 0,25 ml aldehydu glutarowego, 50 ml wody destylowanej, końcowa objętość 65,25 ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 80 obr./min. Usuń roztwór.
5. Umyj żel 100 ml wody destylowanej przez 5 minut i usuń wodę. Powtórz tę procedurę cztery razy.
6. Przeprowadzić barwienie białek 50 ml przefiltrowanego roztworu Coomassie blue R-250 (40% metanolu, 10% kwasu octowego, 50% wody destylowanej, 0,1% barwnika, objętość końcowa 100 ml), mieszając z prędkością 60 obr./min w laboratoryjnym oscylatorze obrotowym w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
7. Odzyskaj roztwór, który można użyć do barwienia innych żeli.
8. Aby usunąć nadmiar barwnika, dodaj roztwór odbarwiający (40 ml metanolu, 10 ml kwasu octowego, 50 ml wody destylowanej). Mieszaj (80 obr./min) przy temperaturze obrotowej, aż prążki (barwione białka) zaczną się uwidaczniać.
9. Przechowuj żel w 50 ml wody destylowanej i zeskanuj obraz w systemie dokumentacji żelu.

7. Test fosfolipazy

1. Umyj jedno jajo kurze z 1% SDS w wodzie destylowanej.
2. Oddziel żółtko od białka w sterylnych warunkach.
3. Przygotuj 50 ml 0,86% roztworu NaCl i przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Następnie przygotuj roztwór A: Dodaj 12 ml żółtka jaja i 36 ml 0,86% roztworu NaCl.
4. Przygotuj roztwór B: Wymieszaj 300 mg agarozy w 50 ml buforu (50 mM Tris, pH 7,5), przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej do wrzenia. Schłodzić w ciepłej wodzie do temperatury 43-45°C.
5. Przygotuj roztwór C: Przygotuj 10 mM CaCl2 i przefiltruj go filtrem 0,22 μm.
6. Przygotuj roztwór D: 10 mg rodaminy 6G w 1 ml wody destylowanej.
7. W sterylnych warunkach (okap z przepływem laminarnym) dodać 500 μl roztworów A i C do roztworu B i 100 μl roztworu D, wymieszać i wlać 25 ml do każdej szalki Petriego (90 x 15 mm).
8. Poczekaj, aż roztwór stężeje w sterylnych warunkach (30 min).
9. Wykonaj studzienki (o średnicy ~2-3 mm) za pomocą cienkiej rurki.
10. Dodać łącznie 20 μl buforu fosforanowego (kontrola ujemna) do jednego dołka i 20 μl oznaczonej fosfolipazy (kontrola dodatnia) do drugiego studzienki.
11. Umieścić różne ilości surowego białka ekstraktu, 5, 15, 25, 35, 45 μg, w pozostałych studzienkach, każdy w końcowej objętości 20 μl.
12. Poczekaj, aż agar zaadsorbuje wszystkie próbki (30 min).
13. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 godzin.
14. Jeśli wokół studni tworzy się halo, oznacza to aktywność fosfolipazy. Zmierz aureolę utworzoną suwmiarką z noniuszem.
    nuta: Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach (kroki od 7.1 do 7.14).

Wyniki

Ryc. 1: Zbieranie ukwiałów. (A) Strefa pływów w El Sauzal, Baja California Norte, Meksyk. (B) Zebrano ukwiał. (C) Anthopleura dowii Verrill, 1869.

Tabela 1: Kwantyfikacja białka za pomocą testu Bradforda.

Rura<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stożkowa probówka wirówkowa 15 ml	Corning	430766
Błękit 2-bromofenolowy	Sigma	Zobacz materiał B75808
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	Silnik M6250-100ML
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Corning	430828
Kwas octowy Lodowaty	J.T. Bakera	Numer katalogowy: 9515-03
Akrylamid	Preparat Promega	Zobacz materiał V3115
Agarozy	Preparat Promega	Zobacz materiał V3125
Bisakryloamid	Preparat Promega	Zobacz materiał V3143
Surowica bydlęca Frakcja albuminy V	Sigma	A3059-100G
Testy białek Bradforda	Bio-Rad	5000006
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C3306
Płytki do hodowli komórkowych 96-dołkowe, V-bottom	Corning	3894
wirówka	Eppendorf	Zobacz materiał 5804R
Probówki wirówkowe	Corning	CLS430829
System ChemiDoc MP	Bio-Rad	1708280
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	251275
Przezroczyste 96-dołkowe płytki z płaskim dnem	Thermo Scientific	3855
Coomassie Błękit Brylantowy G-250	Bio-Rad	#1610406
Coomassie brylantowy niebieski R-250	Bio-Rad	Numer katalogowy: 1610400
Dekstroza	J.T. Bakera	Lata 1916-01
Obudowa bezkanałowa	Labconco	pionowy	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Żel Doc EZ	Bio Rad.		System Dokumentacji Żeli
glicerol	Sigma-Aldrich	G5516-4L
Hemocytometr	Lotnisko Marienfeld	Numer katalogowy: 650030
ImageJ (oprogramowanie)	NIH, Stany Zjednoczone	Wersja 1.53c
Inkubator 211	Labnet	I5211 DS
metanol	J.T. Bakera	Zobacz materiał 9049-03
Komórka tetra Mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658000EDU
Na2HPO4	J.T. Bakera	Nr kat. 3824-01
Zawartość NaCl	J.T. Bakera	3624-01
NaH2PO4.H2O	J.T. Bakera	3818-05
Oprogramowanie Origin		Wersja 9	Aby zaprojektować wykres z korektami sigmoidalnymi
Petrydyjczyk	sokół	351007
Zestaw Pipetmana	Gilson	F167380
Prefabrykowany mini żel	Przedsiębiorstwo BioRad	1658004
Wstępnie zabarwiona drabina białkowa	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 26620
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836153001
Koncentrat odczynnika do oznaczania białek	Bio-Rad	5000006
Rodamina 6G	Sigma-Aldrich	252433
Sds	Sigma-Aldrich	L4509
Cytrynian sodu dwuwodny	J.T. Piekarz	3646-01
Spektrofotometr	THERMO NAUKOWY	G10S WIZJER UV-VIS
Baza Tris	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał 77-86-1
Zasilanie napięciem	Hoefer	Konsola PS300B