1. Produkcja znaczków z polidimetylosiloksanu (PDMS)
- Narysuj tablicę pierścieni w mikroskali za pomocą oprogramowania CAD, o średnicy wewnętrznej 250 μm i średnicy zewnętrznej 450 μm. Wzorzec używany w tym protokole to tablica 10 x 10 z odległością między pierścieniami 850 μm.
- Wydrukuj przezroczystą maskę wzoru w żądanej rozdzielczości, korzystając z usługi drukowania masek firmy zajmującej się mikrofabrykacją (patrz Tabela materiałów).
nuta: Udowodniono, że podane wymiary pierścienia sprawdzają się w przypadku wielu typów ogniw.
- Przeprowadź fotolitografię w ultrafiolecie (UV) przy użyciu maski zawierającej pożądane cechy, aby uzyskać ujemną formę fotorezystu (taką jak SU-8).
- Przykryj płytkę krzemową pokrytą spinowo fotorezystem za pomocą maski przezroczystej wykonanej w krokach 1.1-1.2.
- Na nakładce kontaktowej UV spolimeryzuj fotorezystor pod przezroczystymi obszarami maski za pomocą światła UV.
nuta: Po dalszym myciu i opracowaniu wytwarzana jest forma wzorcowa o pożądanych cechach. Szczegóły operacyjne zależą od konkretnego używanego sprzętu.
- Przygotuj prepolimery elastomerowe PDMS, mieszając je z utwardzaczem w stosunku 10:1, a następnie odlej mieszaninę na formę na szalce Petriego.
- Umieść naczynie w komorze próżniowej na 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z PDMS i piecz w piekarniku w temperaturze 60 °C przez co najmniej 2 godziny.
- Po całkowitym utwardzeniu PDMS wytnij tablice wzorów na stemple.
nuta: Grubsze stemple (około 1 cm) mogą być preferowane ze względu na łatwość obsługi na późniejszych etapach druku mikrokontaktowego.
2. Powłoka szkiełek
- Wyczyść szkiełka podstawowe. Namocz szkiełka w kąpieli 100% etanolowej, sonikuj przez 5 minut, a następnie spłucz wodą.
- Powtórz ten krok najpierw z acetonem, następnie z izopropanolem, a następnie susz w strumieniu azotu.
- Użyj urządzenia do odparowywania wiązką elektronów (wiązką elektronów), aby pokryć warstwy tytanu i złota na szkiełkach szkiełkowych.
nuta: W przypadku warstwy tytanu pożądana grubość wynosi 15 A (1 A = 10-10 m). W przypadku warstwy złota pożądana grubość wynosi 150 A. Najpierw pokryj tytan, a następnie złoto, ponieważ warstwa tytanu służy jako klej między złotem a szkiełkiem.
- Oczyszczone szkiełka należy umieścić w komorze parowania i włożyć pod żaluzje tygle złote i tytanowe.
- Przepompuj w dół komory, aby wytworzyć podciśnienie niższe niż 10-5 Pa przed stopieniem metali. Skoncentruj wiązkę elektronów na metalu i dostosuj moc tak, aby szybkość osadzania była odpowiednia do kontrolowania grubości osadzania.
- Otwórz migawkę, aby rozpocząć osadzanie metalu. Zamknij żaluzję, gdy zostanie osiągnięta żądana grubość.
- Przełączać tygle między sekwencyjnym odparowywaniem dwóch metali.
- Poczekaj, aż tygle ostygną zgodnie z wymaganiami urządzenia, odwietrz komorę i wyjmij szkiełka pokryte złotem.
- Ponownie przepompuj komorę w dół w celu konserwacji sprzętu.
nuta: Szczegóły operacyjne mogą zależeć od konkretnego parownika z wiązką elektronową. Ważne jest, aby dobrze kontrolowany, niski stopień osadzania tytanu był ważny. Gruba warstwa tytanu często prowadzi do słabej widoczności, szczególnie w przypadku obrazowania fluorescencyjnego komórek. Po pokryciu szkiełka ze szkła pokrytego tytanem/złotem można przechowywać w suchej komorze próżniowej w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 miesiąc.
3. Druk mikrokontaktowy
- W razie potrzeby pokrój szkiełko pokryte tytanem/złotem na mniejsze kawałki. Do typowego zastosowania zalecany jest kwadratowy kształt 12 mm x 12 mm (rysunek 1B).
- Użyj noża do szkła, aby przesunąć się po powierzchni, aby pozostawić wgniecioną ścieżkę, a następnie przytrzymaj szkiełko po obu stronach i zegnij wgłębienie, aby rozbić się na małe ćwiartki. Unikaj dotykania powierzchni pokrytej złotem.
nuta: Aby wizualnie określić, która strona szkła jest powlekaną powierzchnią w przypadku przypadkowego przewrócenia, porównaj odbicie światła po obu stronach. Powierzchnia pokryta złotem będzie miała jaśniejsze odbicie, podczas gdy strona niepowlekana będzie miała ciemniejsze odbicie (od warstwy tytanu po drugiej stronie szkła). Alternatywnym sposobem jest obserwacja krawędzi prowadnicy, a stronę powłoki można określić na podstawie pionowej powierzchni cięcia.
- Wyczyść szkiełka, mocząc je w 100% etanolu na szalce Petriego złotą stroną do góry na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 10 minut. Odessać etanol, a następnie wysuszyć każde szkiełko, przedmuchując strumieniem azotu.
- Wyczyść stemple PDMS wodą z mydłem, a następnie 100% etanolem. Wysuszyć stemple gazowym azotem.
- Przygotować 2 mM roztwór oktadekanetiolu (C18), rozpuszczając 5,74 mg proszku C18 w 10 ml 100% etanolu.
nuta: Uszczelnij i przechowuj roztwór C18 w temperaturze pokojowej. Drukowanie wzorów za pomocą C18 tworzy samoprzylepną, samoorganizującą się monowarstwę, do której preferencyjnie przyczepi się fibronektyna i komórki.
- Namocz stemple PDMS w roztworze C18 wzorzystą powierzchnią skierowaną w dół na 10 s i delikatnie osusz azotem przez 60 s.
nuta: Podczas suszenia należy najpierw umieścić strumień z dala od stempla (około 1 m), aż większość płynu wyparuje, a następnie powoli przesuwać strumień bliżej, aby całkowicie wysuszyć stempel. Ma to na celu uniknięcie zdmuchnięcia roztworu C18 zamiast wyschnięcia na stemplu.
- Połóż stempel stroną zadrukowaną do dołu na złotych szkiełkach przez 60 sekund przed usunięciem.
- Aby zapewnić prawidłowe stemplowanie, delikatnie postukaj pęsetą o stempele, aby prawidłowo przenieść wzory. Nie naciskaj zbyt mocno, a waga pęsety jest zwykle wystarczająca.
nuta: Oględziny stempla podczas stukania zapewnią, że stempel i szkiełko zetknęły się równomiernie.
- Przygotuj komory wilgotnościowe.
- Odpipetować 1 ml 70% etanolu do odwróconej pokrywki szalki Petriego i położyć kawałek parafilmu, aby pokryć powierzchnię (przykryty stroną zadrukowaną do góry).
- Użyj pęsety, aby podnieść, połóż parafilm, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza, i w razie potrzeby usuń nadmiar etanolu.
- Przygotować 2 mM roztwór HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3): Rozcieńczyć 5 μl roztworu podstawowego w 5 ml 100% etanolu.
nuta: Rozcieńczony roztwór EG3 można szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze 4 °C, a nierozcieńczony roztwór EG3 należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Obróbka EG3 służy do tego, aby szklany obszar bez C18 nie przywierał do komórek.
- Mikropipeta 40 μl kropelek EG3 na każdą ćwiartkę szkła wsunąć na parafilm w komorze wilgotnościowej, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca między kropelkami, aby uwzględnić odstępy między złotymi szkiełkami.
- Użyj pęsety, aby umieścić złote szkiełka z nadrukiem C18 zadrukowane twarzą w dół na kropelkach i upewnij się, że pod szkiełkami nie ma pęcherzyków. Delikatnie dociśnij szkiełka do siebie, nie podnosząc ich, aby zminimalizować parowanie.
nuta: Umieść jedną krawędź szkiełka w dół w pobliżu kropli, a następnie powoli opuść drugi koniec szkiełka w dół. Jeśli bańka jest obecna, popchnij złoty szkiełko bez podnoszenia go, aż bańka zniknie.
- Szczelnie zamknąć szalkę Petriego parafilmem i pozostawić w temperaturze pokojowej na co najmniej 3 godziny
nuta: Jeśli pożądana jest intensywna inkubacja, należy dwukrotnie zamknąć szalkę Petriego i pozostawić ją na maksymalnie 24 godziny.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść złote szkiełka zadrukowaną do góry na szalce Petriego, namocz i spłucz 3 razy w 70% etanolu, aby usunąć EG3, a następnie pozostaw w etanolu na 10 minut w celu sterylizacji.
- Odessać etanol i zastąpić go sterylnym PBS.
- Przygotuj kolejną komorę wilgotnościową zgodnie z opisem w kroku 3.9, z PBS zamiast etanolu.
nuta: Ze względu na różnicę w napięciu powierzchniowym łatwiej jest najpierw dodać 4-5 ml PBS, aby ułożyć parafilm i usunąć pęcherzyki, a następnie odessać nadmiar.
- Przygotować 50 μg/ml roztworu fibronektyny (inne białka, jeśli jest to pożądane) w sterylnym PBS i mikropipetować 50 μl kropelek roztworu fibronektyny na każdą ćwiartkę szkiełka na parafilm, pozostawiając trochę miejsca między kropelkami.
nuta: Powłoka fibronektyny ułatwia przyleganie komórek do wzorzystych powierzchni.
- Użyj pęsety waflowej, aby umieścić szkiełka zadrukowaną w dół na kropelkach i upewnij się, że pod szkiełkami nie ma pęcherzyków. Delikatnie dociśnij prowadnice do siebie, nie podnosząc ich.
nuta: Do obsługi szkiełek zalecana jest pęseta do szkiełek lub pęseta waflowa z prostymi, szerokimi końcówkami.
- Pozostawić szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut.
- Po 30 minutach umieść złote szkiełka zadrukowaną do góry w PBS po 3-krotnym spłukaniu.
nuta: Szkiełka z wzorem fibronektyny można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez około miesiąc.
4. Umieszczanie komórek na szkiełkach z mikrowzorami
- Podgrzej pożywkę do hodowli komórkowych i trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
nuta: Poniższy opis subkultury dotyczy komórek NIH / 3T3. Warunki hodowli mogą się różnić w zależności od typu komórek.
- (Opcjonalnie) Namocz wzorzyste szkiełka w pożywkach hodowlanych na 12-dołkowej płytce, rozgrzej do 37 °C w inkubatorze przed trypsynizacją komórek w celu lepszego przyłączenia komórek.
- Trypsynizować komórki, neutralizować pożywką zawierającą FBS, odwirowywać przy 100 x g przez 3 minuty, a następnie ponownie zawiesić, dobrze mieszając ze świeżą pożywką.
nuta: Upewnij się, że komórki są całkowicie oddzielone od siebie.
- Policz komórki, rozcieńcz do 200 000 komórek/ml i dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki zawierającej jedno złote szkiełko.
- Delikatnie potrząśnij płytką studzienki kilka razy, aby uzyskać równomierny wysiew komórek i przechowuj ją w inkubatorze przez 15 minut, aby umożliwić przyczepienie komórek.
- Po 15 minutach sprawdź przyczepienie komórek pod mikroskopem. W razie potrzeby daj dodatkowy czas.
nuta: Przyczepione komórki rozprzestrzenią się na powierzchni z widocznym filopodium lub spłaszczeniem i nie będą się ruszać z powierzchni, gdy płytka studzienki zostanie delikatnie stuknięta lub przesunięta.
- Odessać pożywkę zawierającą nieprzyłączone komórki z każdej studzienki i dodać 1 ml pożywki hodowlanej. W przypadku leczenia farmakologicznego na tym etapie należy uzupełnić dodatkowe odczynniki do pożywek hodowlanych.
- Hoduj komórki w inkubatorze przez 24 godziny i sprawdzaj zbieżność, aby określić, czy utworzyła się chiralności.
nuta: Powyżej 75% konfluencji jest zalecana dla większości typów komórek, a nadmierna konfluencja może wpływać na charakterystykę chiralności.
5. Kolekcja obrazów
- Napraw komórki po zbiegu.
- Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki studzienki i spłukać raz PBS.
- Dodać 4% roztwór paraformaldehydu, inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie spłukać 3 razy PBS.
UWAGA: Jeśli fiksacja znacząco zmienia morfologię komórki, zaleca się obrazowanie przed fiksacją
- Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym z funkcją kamery, zobrazuj każdy pierścień na szkiełkach w wysokiej rozdzielczości (do analizy wystarczy soczewka obiektu 10x).
6. Charakterystyka chiralności komórek (Rysunek 2)
- Pobierz pliki z kodem MATLAB do charakterystyki chiralności.
- Dodaj folder kodu i podfoldery (z cyklicznym przybornikiem statystycznym w środku) do ścieżki MATLAB i otwórz plik "ROI_selection.m". W wierszu 4 zmień katalog na żądany folder danych (dla użytkowników okien zmień "/" na "\" w wierszach 4 i 5).
- Zmień rozmiar obrazu w wierszu 14, przy czym pierwsze dwie cyfry reprezentują rozmiar wewnętrznego okręgu pierścienia, a pozostałe dwie reprezentują zewnętrzny.
nuta: Upewnij się, że rozmiary wszystkich obrazów w folderze, który ma być analizowany, są identyczne.
- Kliknij przycisk Uruchom, aby wykonać kod MATLAB "ROI_selection.m" w celu określenia obszaru zainteresowania (ROI) na obrazach z kontrastem fazowym.
- Ręcznie przeciągnij kwadrat zaznaczenia, aby pasował do pierścienia, a następnie kliknij dwukrotnie obraz, aby potwierdzić wybór.
- Powtórz ten krok dla każdego obrazu w folderze (następny obraz pojawi się automatycznie po potwierdzeniu wyboru ROI poprzedniego obrazu); zostanie wygenerowany plik ".mat" do przechowywania informacji o ROI dla każdego obrazu.
- Otwórz plik "Analysis_batch.m" i zmień katalog folderu tak samo jak w kroku 6.2. (Dla użytkowników okien, przy pierwszym użyciu, zamień "/" na "\" w wierszach 5, 6, 124 i 130)
- Kliknij przycisk Uruchom, aby wykonać kod "Analysis_batch.m" w celu określenia chiralności wielu wzorców pierścieni komórkowych. Zostanie wygenerowany plik "datatoexcel.txt", zawierający statystyki kołowe dla każdego pierścienia, a także liczbę pierścieni zgodnych z ruchem wskazówek zegara, niechiralnych i przeciwnych do ruchu wskazówek zegara.
