Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: metoda wizualizacji i ilościowego określania wychwytu komórkowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu techniki obrazowania fluorescencyjnego 3D

Abstract

Źródło: Kim, C. J., et al., Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania mikroskopu konfokalnego. J. Vis. Exp. (2022).

W tym filmie demonstrujemy test do wizualizacji i ilościowego określenia poboru komórkowego przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV. Test ten wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego i pozwala na odróżnienie zinternalizowanych EV od tych przyklejonych do powierzchni komórki.

Protocol

1. Izolacja EV i immunofluorescencyjne znakowanie EV na chipie

1. Pobieranie pożywek do hodowli komórkowych (CCM) i wstępne przetwarzanie CCM w celu izolacji EV
   1. Zasiewaj komórki PC3 przy 30% zbiegu w kolbie hodowlanej o średnicy 75 cm2. Pozwól komórkom kontrolnym rosnąć do 90% zbiegu (~48 godzin) w standardowych pożywkach i suplementach specyficznych dla linii komórkowych.
      nuta: Aby zapobiec wpływowi składników zawierających EV na wychwyt komórkowy (tj. płodową surowicę bydlęcą), należy stosować pożywki i suplementy zubożone w egzosomy.
   2. Zbierz CCM.
   3. Odwirować CCM przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu osadzenia wszelkich nieprzyłączonych komórek i dużych zanieczyszczeń zebranych za pomocą pożywki. Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki.
   4. W nowej probówce odwirować supernatant o stężeniu 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzać mniejsze zanieczyszczenia i ciała apoptotyczne pozostające w pożywce. Niektóre większe pojazdy elektryczne będą peletować. Przenieść supernatant do nowej probówki.
   5. Przefiltrować supernatant przez hydrofilowy filtr strzykawkowy z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF) o średnicy 0,45 μm.
      nuta: Jeżeli CCM nie zostanie natychmiast przetworzony w celu izolacji EV, należy przechowywać wstępnie przetworzony CCM w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia izolacji. W przypadku zamrożenia ogranicz cykle zamrażania i rozmrażania do jednego.
2. Izolacja EV od CCM za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji
   1. W przypadku zamrożenia całkowicie rozmrozić CCM i wirować przez 30 s przed krokiem 1.2.2.
   2. Wstrzyknąć 1 ml wstępnie przetworzonego CCM (krok 1.1) do komory próbki urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji (patrz tabela materiałów).
      nuta: Postępuj zgodnie ze standardową procedurą operacyjną dla urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.
   3. Wirować z prędkością 3000 obr./min przez 10 minut w wirówce stołowej (patrz tabela materiałów), aby uruchomić urządzenie mikroprzepływowe.
      nuta: Jeżeli CCM pozostanie w komorze na próbkę po pierwszym uruchomieniu, należy wykonać dodatkowe wirowania, aż cały CCM zostanie opróżniony z komory próbki.
   4. Usunąć płyn z komory na odpady za pomocą pipetowania i powtórzyć kroki 1.2.1, 1.2.2 i 1.2.3 dwukrotnie.
      nuta: W sumie 3 ml CCM zostaną przetworzone do izolacji EV.
   5. Wstrzyknąć 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do komory na próbkę w celu przemycia wyizolowanych EV. Zakręć wirówkę stołową do obsługi urządzenia mikroprzepływowego, jak wspomniano w kroku 1.2.3. Zlokalizuj czyste EV na membranie urządzenia.
      nuta: Jakość EV wyizolowanych z urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji została potwierdzona i porównana z konwencjonalną metodą UC za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA), mikroskopii oświetlenia strukturalnego, testu immunoenzymatycznego i PCR w czasie rzeczywistym w poprzednich badaniach.
3. Znakowanie immunofluorescencyjne EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji (ryc. 1)
   1. Należy wybrać przeciwciało specyficzne dla EV zgodnie z celem testu (patrz tabela materiałów).
      nuta: Niektóre przeciwciała mogą zakłócać miejsca wiązania ligandów specyficzne dla szlaków wychwytu EV (tj. endocytozy).
   2. Wstrzyknąć 1 μg/ml przeciwciała swoistego dla EV do otworu elucyjnego urządzenia zawierającego 100 μl wyizolowanych EV.
   3. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytkowej, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie przeciwciała w próbce.
   4. Przymocuj taśmę klejącą do otworu elucyjnego. Wstrzyknąć 1 ml PBS do komory na próbkę, aby wypłukać wszelkie pozostałości przeciwciał.
   5. Obracać urządzeniem z prędkością 3000 obr./min, aż komora na próbkę będzie pusta. Usunąć płyn z komory na odpady za pomocą pipetowania. Wstrzyknąć 1 ml PBS do komory na próbkę.
      nuta: Oznakowane fluorescencyjnie EV zostaną umieszczone w komorze membranowej.
   6. Odpipetować fluorescencyjnie oznakowane EV (rysunek 2) z komory membranowej do bursztynowej probówki. Blokuj przed światłem do czasu użycia.

2. Inkubacja komórek z fluorescencyjnie znakowanymi EV do testu absorpcji EV

1. Docelowe wysiewanie komórek i hodowla na szalkach kompatybilnych z kulturami komórkowymi.
   1. Umieść 1 x 10⁴ komórki PC3 na 8-dołkowej płytce mikroszkiełkowej (9,4 x 10,7 mm na każdą studzienkę) z 0,2 ml pożywki lub 4 x 10⁴ komórek PC3 do 35-milimetrowej płytki z 1 ml pożywki. Umieść komórki w naczyniu kompatybilnym z kulturami komórkowymi składającym się z cienkiego szkiełka nakrywkowego (grubość: 0,18 mm).
      nuta: Cienkie szkiełko nakrywkowe minimalizuje niekorzystne rozpraszanie światła.
   2. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w optymalnych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% stężenie CO₂, 90% wilgotność).
   3. Przemyj przylegające komórki dwukrotnie pożywką zubożoną w egzosomy (opisaną w kroku 1.1.1).
2. Inkubacja komórek za pomocą znakowanych fluorescencyjnie EV.
   1. Zmierzyć stężenie znakowanych fluorescencyjnie EV (krok 1.3.5) za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA, rysunek 3). Określić optymalne stężenie znakowanych fluorescencyjnie EV, które mają być dodane do hodowanych komórek (krok 2.1.2).
   2. Rozcieńczyć znakowane fluorescencyjnie EV pożywką zubożoną w egzosomy, aby dopasować do pożądanego stężenia zmierzonego w kroku 2.2.1. (tj. 7,80 x 10⁹ EV (w wartości NTA) w 200 μl pożywki zubożonej w egzosomy.)
   3. Dodać rozcieńczone EV (etap 2.2.2) do przylegających komórek docelowych przygotowanych w ppkt 2.1.2. Inkubować przez czas doświadczalny (tj. 4, 8 lub 12 godzin).
   4. Umyj komórki trzykrotnie pożywką wolną od egzosomów, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane EV.
      nuta: Opcjonalnie: Komórki można utrwalić po umyciu.
   5. Oznaczyć cytoplazmę przylegających komórek 1 μg/ml CMTMR ((5-(i-6)-(((4-chlorometylo)benzoilo)amino)tetrametylorodaminy) (patrz tabela materiałów) i inkubować w optymalnych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% stężenie CO₂, 90% wilgotności).
      nuta: Barwniki obszaru komórkowego powinny fluoryzować oddzielnie od znakowanych EV, aby pomóc w określeniu lokalizacji przestrzennej (zinternalizowanej lub powierzchownej) wzbogaconych EV podczas testu wychwytu EV.
   6. Umyj znakowane komórki dwukrotnie pożywką zubożoną w egzosomy, aby usunąć resztki barwnika. Dodaj do komórek świeże podłoże zubożone w egzosomy, przygotowując się do obrazowania konfokalnego żywych komórek.

3. Mikroskopia konfokalna

1. Aby wykonać obrazowanie żywych komórek, należy użyć inkubatora na etapie, aby utrzymać optymalne warunki hodowli komórek (37 °C, 5% stężenie_CO2, 90% wilgotność).
2. Umieść przygotowane komórki w inkubatorze na etapie.
3. Ustaw parametry obrazowania na podstawie próbek kontrolnych.
   nuta: Sugerowane próbki kontrolne obejmują: tylko fluorescencyjnie znakowane EV, fluorescencyjnie znakowane komórki, nieznakowane EV i nieznakowane komórki.
4. Określ głębokość komórek docelowych i zakres rozmiaru stosu w kierunku z, aby uzyskać obrazy konfokalne 3D.
   nuta: Grubość stosu Z wynosi 1 μm. Akwizycja konfokalnego obrazu 3D trwała 2 min 34 s (każda akwizycja obrazu w płaszczyźnie Z trwała około 8 s; w sumie dwadzieścia obrazów w stosie Z).
5. Ustaw akwizycję obrazu na wiele obrazów ułożonych w stos z zarówno barwnika specyficznego dla komórki (tj. czerwonego), jak i barwnika specyficznego dla EV (tj. zielonego) jednocześnie (Rysunek 4 i Rysunek 5A).

4. Przetwarzanie obrazu

1. Wykorzystaj oprogramowanie do automatycznego przetwarzania obrazu, aby przeanalizować surowe obrazy konfokalne z ułożonymi w stos z i określić wychwyt EV przez komórki (patrz tabela materiałów).
2. Ustaw parametry progowe na sygnał fluorescencyjny komórek i barwniki specyficzne dla EV. Zbuduj wirtualne powierzchnie komórek (Rysunek 5A,B).
   1. Aby zbudować wirtualne powierzchnie komórek, kliknij przycisk Dodaj nowe powierzchnie.
   2. Wybierz opcję Obliczanie najkrótszej odległości jako "Ustawienia algorytmu", aby użyć algorytmu dostarczonego przez oprogramowanie, a następnie kliknij przycisk Dalej: Kanał źródłowy.
   3. Wybierz Kanał 2 — CMTMR jako "Kanał źródłowy" w tym eksperymencie.
   4. Wybierz opcję Wygładź i wprowadź odpowiednią wartość w polu "Szczegóły powierzchni" dla wygładzania powierzchni.
      UWAGA: 0,57 μm w tym eksperymencie, ponieważ 1 piksel odpowiada 0,57 μm w surowych danych obrazowania.
   5. Wybierz Intensywność bezwzględną jako "Thresholding".
   6. Aby automatycznie progować obraz fluorescencyjny za pomocą podanego algorytmu, kliknij opcję Threshold (Absolute Intensity) (Próg (intensywność bezwzględna): Wartość jest ustawiana automatycznie.
   7. Wybierz opcję Włącz jako "Podziel stykające się obiekty (rosnący region)" i umieść wartość szacowanego rozmiaru komórki w polu "Średnica punktów początkowych", 10,0 μm w tym eksperymencie. Następnie kliknij przycisk Dalej: Filtruj punkty początkowe.
   8. Aby skonfigurować wirtualne powierzchnie komórek, kliknij przycisk + Dodaj, a następnie wybierz Jakość jako "Typ filtra". Określ odpowiednią wartość (210 w tym eksperymencie) dla dolnego limitu za pomocą oględzin i maksymalną wartość (1485) dla górnego limitu, a następnie kliknij przycisk Zakończ.
      nuta: Oględziny oznaczają, że badacz może odróżnić obszar komórkowy od surowego obrazu fluorescencyjnego.
   9. Następnie, aby zbudować wirtualne kropki pojazdów elektrycznych, kliknij przycisk Dodaj nowe miejsca.
   10. Wybierz Różne rozmiary plamki (Rosnący region) i Obliczanie najkrótszej odległości jako "Ustawienia algorytmu", a następnie kliknij Dalej: Kanał źródłowy.
   11. Wybierz Kanał 1 - Alexa Fluor 488 jako "Kanał źródłowy" w tym eksperymencie.
   12. Wprowadź odpowiednią wartość w polu "Szacowana średnica XY" dla wykrywania punktowego, 1 μm w tym eksperymencie. Następnie kliknij przycisk Dalej: Filtruj miejsca.
   13. Aby skonfigurować wirtualne kropki EV, kliknij przycisk + Dodaj, wybierz Jakość jako "Typ filtra" i ustaw "Dolny próg" przez oględziny, 100 w tym eksperymencie. Następnie kliknij przycisk Dalej: Typ regionu dodatkowego.
   14. Wybierz opcję Absolute Intensity (Intensywność bezwzględna) jako "Typ regionów dodatkowych", a następnie kliknij przycisk Next: Spot Regions.
   15. Aby określić próg, region kropek EV, wprowadź odpowiednią wartość w polu "Próg regionu" przez oględziny, 100 jako "Próg regionu" w tym eksperymencie.
       nuta: Oględziny oznaczają, że badacz może odróżnić obszar EV od surowego obrazu fluorescencyjnego.
   16. Wybierz opcję Objętość regionu jako "Średnica od", a następnie kliknij przycisk Zakończ.
3. Użyj algorytmów dostarczonych przez oprogramowanie, aby podzielić zgrupowane miejsca wewnątrz zbudowanej powierzchni w kroku 4.2 (Rysunek 5C, i-iv).
   1. Kliknij utworzone spoty, a następnie przejdź do sekcji Filtry.
   2. Kliknij przycisk + Dodaj, a następnie wybierz Najkrótsza odległość do powierzchni Powierzchnie = Powierzchnia 1 jako Typ filtru, a następnie kliknij przycisk Powiel wybór do nowych miejsc. Najniższy próg (-7,0 w tym eksperymencie) dla dolnej granicy i odpowiednia wartość (-0,5) dla górnej granicy.
      nuta: Ustaw górny limit za pomocą szacowanego promienia spotów. W tym eksperymencie szacowana średnica plamek, tj. kropek EV, została ustawiona na 1 μm w kroku 4.2.11. W związku z tym górna granica może wynosić 0,5.
4. Automatyczne zliczanie EV wewnątrz komórek
   nuta: Oprogramowanie automatycznie zliczy liczbę EV wewnątrz komórek, wskazując liczbę zinternalizowaną przez komórki docelowe.
   1. Kliknij utworzony wybór Miejsca 1 [Najkrótsza odległość do powierzchni = Powierzchnie 1 z zakresu od -7,00 do -0,500].
   2. Przejdź do Statystyk i wyeksportuj wartość z "Całkowitej liczby miejsc"
      nuta: Algorytmy dostarczone przez oprogramowanie automatycznie obliczą liczbę i objętość komórek.
5. Określić wydajność wychwytu EV w okresie inkubacji na podstawie wyżej obliczonych wartości (rysunek 6).
   1. Aby uzyskać liczbę komórek, kliknij utworzone Powierzchnie 1, a następnie przejdź do Statystyk i wyeksportuj wartość "Całkowita liczba powierzchni" z pola Ogółem.
   2. Przejdź do Szczegółowe do Statystyki, aby wyeksportować wolumin ze Szczegółowego.

Results

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja izolacji EV i etykietowania na chipie za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji. (A) Izolacja EV od CCM. (B) Znakowanie immunofluorescencyjne EV na chipie. (C) Usunięcie niezwiązanych przeciwciał.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 przeciwciało anty-ludzkie CD63	Legenda biologiczna	353038	Przeciwciało swoiste specyficzne dla EV sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym
CellTracker Pomarańczowy barwnik CMTMR	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał C2927	Odczynnik do znakowania fluorescencyjnego żywych komórek (cytoplazmy)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Obiektyw do obrazowania konfokalnego, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Obiektyw do obrazowania konfokalnego, NA=0,75
Dysk egzodyskowy	Labspinner Inc.	EX-D1001	Urządzenie mikroprzepływowe oparte na nanofiltracji do izolacji pojazdów elektrycznych
Odkrycie egzologiczne	Labspinner Inc.	EX-R1001	Urządzenie operacyjne dla Exodisc
FBS zubożony w egzosomy	Thermo Fisher Naukowy	A2720801	Składnik odżywczy pożywki do hodowli komórkowych do zbierania EV pochodzących z linii komórkowej PC3
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Firma VWR	1500-500	Składnik odżywczy do hodowli komórek
Kozia anty-mysia IgG H&L wstępnie zaadsorbowana	Biblioteka ABCAM	ab7063	Mysie przeciwciało IgG do negatywnej kontroli znakowania EV
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	Numer katalogowy: 81156	Naczynie hodowlane do obrazowania konfokalnego
Imaris 9.7.1	Instrumenty oksfordzkie	9.7.1	Oprogramowanie do przetwarzania po obrazie
System inkubatora + mieszalnik gazów CO2/O2/N2	Instrument komórkowy na żywo	TU-O-20	System inkubatora do obrazowania żywych komórek
Aparat Nikon A1 HD25 / A1R HD25	Nikon	nie	Kamera do obrazowania konfokalnego
Mikroskop Nikon Eclipse Ti	Nikon	nie	Mikroskop odwrócony do obrazowania konfokalnego
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	godz. 4.50.00	Oprogramowanie do przetwarzania obrazu do mikroskopu Nikon
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	Silnik NS500	Urządzenie pomiarowe stężenia EV
Początki Pro 2020	Laboratorium Początkowe	9.7.0.185	Oprogramowanie do tworzenia wykresów
Penicylina-Streptomycyna	Thermo Fisher Naukowy	15140122	Antybiotyki do hodowli komórek
Silnik RPMI 1640	Thermo Fisher Naukowy	21875034	Pożywki do hodowli komórkowych do hodowli linii komórkowych PC3
SYTO RNASelect Zielone barwienie fluorescencyjne - 5 mM roztwór w DMSO	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał S32703	Barwnik fluorescencyjny barwiony RNA do znakowania EV