Test wychwytywania cząstek wirusopodobnych: metoda izolowania VLP wyświetlających antygen z próbki przy użyciu neutralizujących kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami

Streszczenie

Źródło: Rosengarten, J. F., et al. Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) przy użyciu testu wychwytywania. J. Vis. Exp. (2022).

W tym filmie pokazujemy test immunoprecypitacyjny, zwany testem wychwytywania VLP, w celu wyizolowania z próbki cząstek wirusopodobnych wyświetlających antygen lub VLP. Antygen wiąże się ze specyficznymi przeciwciałami związanymi z kulkami magnetycznymi, tworząc unieruchomiony kompleks antygen-przeciwciało, który jest następnie oddzielany i przechowywany do dalszej analizy.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Wysiewaj linie komórek zawiesinowych wytwarzających VLP pochodzące z komórek 293-F wykazujących ekspresję genów strukturalnych HIV gag samodzielnie lub w połączeniu z env przy niskiej gęstości komórek 0,5 x 10⁶ komórek na ml w pożywce ekspresyjnej 293-F.
2. Pozwól im rozszerzać się przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C i 8% CO₂ w inkubatorze wytrząsarki obracającej się z orbitą 5 cm i 135 rundami na minutę (obr./min).
3. Komórki produkcyjne osadzać przez odwirowanie przy 100 x g przez 5 minut. Przefiltrować oczyszczony supernatant w celu usunięcia resztek komórek i resztek komórkowych za pomocą filtrów strzykawkowych z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF) 0,45 μm w celu uzyskania bezkomórkowego supernatantu do hodowli komórkowych (CFSN).
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. CFSN można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Albo użyć CFSN bezpośrednio do eksperymentu, albo osadzać VLP z 35 ml CFSN, stosując ultrawirowanie (112 700 x g, 4 °C, 1,5 h).
5. Po ultraodwirowaniu wyrzucić supernatant i zawiesić granulki VLP w 200 μl 15% (w/v) roztworu trehalozy na probówkę wirówkową.
   UWAGA: Granulka VLP często nie jest widoczna gołym okiem. W tym miejscu protokół można wstrzymać. VLP mogą być przechowywane w temperaturze –80 °C.
6. Przed testem wychwytywania VLP należy określić stężenia białka rdzeniowego wirusa w próbkach zawierających VLP za pomocą testu ELISA. Ten krok jest ważny dla standaryzacji danych wejściowych testu przechwytywania.

2. Test wychwytywania VLP

UWAGA: Przegląd przepływu pracy jest przedstawiony na rysunku 1.

1. Zawiesić kulki magnetyczne, pipetując w górę i w dół lub mieszając na rotatorze z prędkością 50 obr./min przez co najmniej 5 minut.
2. W międzyczasie należy przygotować roztwór przeciwciał zawierający bNAbs. Użyć 10 μg każdego bNAb w 200 μl buforu wiążącego i myjącego przeciwciała (patrz tabela materiałów) na reakcję.
   UWAGA: Ilości przeciwciał mogą się różnić w zależności od powinowactwa bNAb i gęstości dekoracji antygenu na użytych VLP.
3. Użyć 50 μl roztworu kulek magnetycznych (patrz Tabela materiałów) na reakcję i przenieść kulki do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Umieść probówki na stojaku do separacji magnetycznej.
   UWAGA: Alternatywnie, do każdej rurki można użyć silnego pojedynczego magnesu, aby oddzielić kulki od supernatantu.
4. Poczekaj kilka minut, aż koraliki zbiorą się na ściance rury, aby upewnić się, że wszystkie koraliki zostały zebrane. Usunąć supernatant.
5. Usunąć magnes i zawiesić kulki w 200 μl roztworu bNAb przygotowanego w kroku 2.2. Inkubować przez 30 minut do 3 godzin, mieszając na rotatorze przy 50 obr./min w temperaturze pokojowej.
6. Ponownie umieścić probówki reakcyjne w stojaku do separacji magnetycznej, odczekać i usunąć supernatant.
7. Wyjmij probówki z magnesu i umyj kulki, ponownie zawieszając w 200 μl buforu wiążącego przeciwciała i myjącego.
8. Powtórz krok 2.4. Usuń jak najwięcej buforu do mycia.
9. Dodaj próbki do powiązanego ze stopkami bNAbs.
   UWAGA: Wejście VLP do testu wychwytywania przy użyciu cząstek pochodzących od HIV powinno wynosić co najmniej 15 ng białka rdzenia wirusa na reakcję. Ilości VLP mogą się różnić w zależności od powinowactwa bNAb i gęstości dekoracji antygenu na użytych VLP.
10. Jeśli objętość próbki dodanej w kroku 2.9 jest mniejsza niż 1 ml, dodaj PBS, aby dostosować objętość próbki do 1 ml. Delikatnie zawiesić kulki, pipetując.
11. Inkubować próbki i kulki przez 2,5 godziny na rotatorze w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że kulki pozostają w zawiesinie, a roztwór jest dokładnie wymieszany podczas inkubacji.
12. Umieść rurki na magnesie i usuń supernatant.
13. Umyj kulki magnetyczne, zawieszając je w 200 μl buforu myjącego (patrz Tabela Materiałów). Powtórz krok prania trzy razy.
14. Zawiesić kulki w 100 μl buforu płuczącego i przenieść zawiesinę do czystej (żaroodpornej) rurki reakcyjnej.
15. Umieścić probówkę na stojaku do separacji magnetycznej (patrz Tabela materiałów) i całkowicie usunąć supernatant.
16. Przygotować zdenaturowane próbki SDS-PAGE zgodnie z krokami 2.16.1-2.16.2 lub próbki niedenaturowane, eluując VLP z kulek magnetycznych zgodnie z krokami 2.16.3-2.16.5.
    1. Aby przygotować zdenaturowane próbki SDS-PAGE, zawiesić kulki w 20–80 μl buforu Laemmli (0,8 μl buforu Laemmli na 1 ng wejściowego testu p55 Gag) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    2. Postępuj bezpośrednio z SDS-PAGE lub przechowuj próbki w temperaturze -20 °C.
       UWAGA: Bufor Laemmli zawiera 2-merkaptoetanol i dodecylosiarczan sodu. Nosić rękawice ochronne i okulary ochronne. Unikaj kontaktu ze skórą, oczami i ubraniami. Nie wdychać oparów. Pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, np. pod wyciągiem.
       UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    3. Alternatywnie należy wykonać etap elucji bez denaturacji, aby otrzymać VLP z zachowaną natywną strukturą białkową.
    4. Dodać 25 μl buforu elucyjnego (często dostarczanego z kulkami) do kulek magnetycznych i inkubować przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń kulki i przenieś eluat do czystej probówki. Eluat należy wykorzystać do kolejnych testów lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
       UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja kluczowych etapów testu wychwytywania VLP przy użyciu supernatantów bezkomórkowych. (1) Test wychwytywania VLP rozpoczyna się od wiązania bNAbs HIV-1 z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. W międzyczasie przygotowuje się roztwór VLP o określonym stężeniu p55. Supernatant do hodowli bezkomórkowych składa się z mieszaniny p55 Gag VLPs, bia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki reakcyjne 1,5 ml	Eppendorf
10 kanałów PBS	Certyfikat Gibco	70011044
Przeciwciała (bnAbs)	Polymun Naukowy
Dynabeads Białko G Zestaw do immunoprecypitacji	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	Numer katalogowy 10007D	Zawiera i mycie Rozwiązania
Kuwety FreeStyle 293-F	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	Przekaźnik R790-07
FreeStyle 293 Expression Średni	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Stojak do separacji magnetycznej	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	S1509S	do probówek 12 x 1,5 ml lub 6 x 1,5 ml
Ultrawirówka Optima XE-90	Beckman Coulter
Polifluorek winylidenu (PVDF) Filtry strzykawkowe, 0,45 μm	Carla Rotha	Zobacz materiał KC89.1
Membrana transferowa PVDF, 0,45 μm	Carla Rotha	Zobacz materiał T830.1
Test ELISA QuickTiter HIV p24	Laboratoria biologiczne Cell	VPK-108-H
Rotator	Heidolph	REAX2
Wirnik SW28	Beckman Coulter
Mieszalnik termiczny	Cel Media	podstawowy
Trehaloza dwuwodna	Carla Rotha	Zobacz materiał 8897.2
Probówki wirówkowe Ultra Clear	Beckman Coulter	344058