$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Nowy projekt komory (Rysunek 1)
- Otwórz nową dwukomorową płytkę analizatora komórek. Odłóż na bok górną komorę z elektrodami.
- Za pomocą frezarki ogolić 2 mm dolnych studzienek w kształcie litery U płytki analizatora komórek.
- Przymocuj membranę polieterosulfonową (PES) o wymiarach 2 cm x 7 cm z porami o wielkości porów 0,2 μm do dna ogolonych studzienek za pomocą kleju zabezpieczonego promieniami UV. Odczekaj 30 minut, aby upewnić się, że klej jest całkowicie utwardzony i obojętny.
- Za pomocą frezarki wytnij dwie podłużne szczeliny (1,5 mm x 5,6 mm) po bokach, aby zatrzasnąć się w grzbietach nowo wyprodukowanej trzeciej komory.
- Za pomocą frezarki utwórz trzecią komorę poliwęglanową, która odwzorowuje całkowite wymiary płytki analizatora komórek; 72 mm x 18 mm (tabela materiałów).
- Utwórz studzienki o głębokości 4,8 mm i średnicy 4,75 mm, aby odtworzyć 16-dołkową konstrukcję płytki analizatora komórek. Pozwala to na uzyskanie 90 μl objętości na studzienkę.
- Po bokach utwórz dwa trójkątne grzbiety, tak aby komora zablokowała się w oryginalnych szczelinach utworzonych w kroku 1.4. Pozioma część trójkąta wynosi 1,5 mm, pionowa 1,4 mm, a przeciwprostokątna 2,052 mm.
- Na krótszym boku utwórz pokrętło o średnicy 50,8 mm i wysokości 1,397 mm, aby pasowało do wycięcia oryginalnej płytki (Rysunek 1, środek).
- Użyj gumowej podkładki o grubości 0.9 mm do każdej studzienki, aby zapewnić uszczelnione dopasowanie.
2. Hodowla komórkowa (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasty)
- Przemyć przylegające kultury komórkowe (~70% konfluencji) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Dodaj 0,05% roztwór trypsyny-EDTA, aby usunąć komórki.
- Zneutralizować roztwór trypsyny pożywką do hodowli komórkowych zawierającą surowicę i policzyć komórki, używając podwielokrotności zawiesiny komórkowej.
nuta: Konkretne pożywki do hodowli komórkowych można znaleźć w tabeli 1.
3. Dysocjacja ksenoprzeszczepu pochodząca od pacjenta
- Pokrój świeży kawałek guza (1cm2) na drobną papkę za pomocą sterylnego skalpela.
- Umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 20 ml pożywki DMEM F12 uzupełnionej 3 mg / ml trypsyny i 2 mg / ml kolagenazy.
- Inkubować w wytrząsarce termicznej (150 obr./min) w temperaturze 37°C przez 20 min.
- Wirować probówkę o masie 500 x g przez 5 minut; usunąć supernatant.
- Dodać 20 μl DMEM F12 + 2% FBS, aby przepłukać komórki; wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
- Ponownie zawiesić w 1 ml pożywki PDX (Tabela 1), aby policzyć komórki.
4. Ekstrakcja komórek szpiku kostnego
- Przepłukać filtr zbiorczy szpiku kostnego (BM) 25 ml 1x PBS.
nuta: W tym badaniu PBS dodano do używanego filtra zbiorczego BM ze szpitala w celu zebrania pozostałego BM w filtrze.
- Powoli dodaj przepłukany BM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 25 ml pożywki o gradiencie gęstości, uważając, aby warstwy były jak najbardziej oddalone.
- Wirować z prędkością 800 x g przez 20 minut w temperaturze 18 °C.
- Odsysić górne warstwy po odwirowaniu (tłuszcz/osocze) i przenieść 5 ml białej warstwy powyżej pożywki o gradiencie gęstości, która zawiera komórki BM, do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
nuta: Alternatywnie, zanurzyć pipetę o pojemności 5 ml w górnej warstwie, aż dotknie środkowej warstwy (BM), i bardzo powoli odpipetować środkową warstwę, nie przesuwając pipety.
- Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml 1x PBS (~10 ml) i wiruj z prędkością 300 x g przez 15 minut.
- Usunąć supernatant; pozostała biała osadka to BM.
- Jeśli w osadzie zaobserwuje się czerwone krwinki, dodaj 5 ml roztworu do lizy RBC (tabela materiałów) i pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Wirować w 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
- Dodaj 10 ml 1x PBS, aby umyć komórki, wirować w 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtarzać lizę RBC (krok 4.7), aż osadek stanie się biały.
5. Sadzenie i składanie komórek
- Umieść wszystkie trzy sterylne komory w kapturze do hodowli tkankowych.
- Znajdź pokrętło na krótszym boku dolnej komory. Ustaw dolną komorę tak, aby pokrętło było skierowane w stronę eksperymentatora.
- Dodaj 30 000-50 000 komórek w 90 μl pożywki do każdego dołka dolnej komory. Unikaj tworzenia się bąbelków. Są to komórki zrębowe, które dostarczą wydzielanych czynników, ale nie zostaną wykryte przez elektrody górnej komory.
- Stosować 5% pożywki wzbogaconej płodową surowicą bydlęcą w dwóch studzienkach dolnej komory jako pozytywną kontrolę ruchliwości komórek. Stosować pożywkę 0% uzupełnioną surowicą jako kontrolę negatywną.
- Pozostaw dolną komorę z komórkami na 10-15 minut w okapie, aby się uspokoiła.
nuta: Ten krok jest zalecany, jeśli komórki przylegają lub rosną w zawiesinie.
- Obróć dolną komorę o 90° i umieść środkową komorę na górze, tak aby pokrętło na dolnej komorze wsunęło się w wycięcie w środkowej komorze.
nuta: Pokrętło na dolnej komorze i niebieska kropka na środkowej komorze znajdują się na przeciwległych końcach zespołu.
- Dociśnij pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.
- Dodać 160 μl pożywki bez surowicy do wszystkich studzienek środkowej komory.
- Upewnij się, że menisk w kształcie kopuły jest widoczny po napełnieniu studzienek; w przeciwnym razie dostosuj końcową objętość w oparciu o kalibrację pipety. Unikaj tworzenia się bąbelków.
- Umieść górną komorę z elektrodami skierowanymi w dół na środkową komorę, upewniając się, że niebieskie kropki są wyrównane na środkowej i górnej komorze.
- Dociśnij pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.
- Do górnej komory dodać 25-50 μl podłoża bez surowicy.
- Zamontuj zestaw na dwufunkcyjnym analizatorze komórek w inkubatorze do hodowli tkankowych i odczekaj 30 minut przed pomiarem tła.
nuta: Czas ten jest niezbędny do zrównoważenia macierzy i może być wykorzystany do przygotowania linii komórkowych, które mają zostać dodane do górnej komory.
- Zmierzyć tło (patrz sekcja 6) i umieścić zestaw z powrotem w kapturze do hodowli tkankowych.
- Dodaj 30 000-50 000 komórek w 100 μl pożywki bez surowicy do każdego dołka górnej komory. Są to komórki, które elektroda wykryje po pomyślnej migracji przez membranę
nuta: Aby osiągnąć maksymalną odpowiedź, zaleca się hodowlę komórek w pożywce bez surowicy lub o niskiej surowicy przez 6-18 godzin przed wykonaniem testu.
- Pozostaw zespół w osłonie na 30 minut przed zamontowaniem na dwufunkcyjnym analizatorze ogniw do pomiaru impedancji.
6. Pomiar tła i impedancji
- Umieść macierz w podstawce dwufunkcyjnego analizatora komórek.
- Otwórz oprogramowanie analizatora komórek i wybierz podstawkę, która ma być używana.
- Kliknij kartę Wiadomość i upewnij się, że jest na niej napisane Połączenia OK, aby upewnić się, że matryca jest dobrze umieszczona w podstawce, a elektrody są dobrze wyrównane z czujnikami.
- Kliknij zakładkę Notatki z eksperymentu i podaj jak najwięcej informacji o eksperymencie.
- Kliknij zakładkę Układ i wypełnij opis układu tablicy.
- Kliknij kartę Harmonogram i dodaj dwa kroki z menu Kroki: krok w tle (jedno przeciągnięcie) i krok testowy ze 100 przebiegami - przemiatanie co 15 minut, w sumie 25 godzin.
- Po 30 minutach przebywania matrycy w inkubatorze dwufunkcyjnego analizatora komórek, kliknij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć pomiar tła. Pojawi się okno z prośbą o wybranie folderu, w którym chcesz zapisać dane.
- Po wykonaniu pomiaru tła wyjmij matrycę z kołyski i umieść ją z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych.
- Dodaj komórki do górnej komory zgodnie z opisem w kroku 5.13 i trzymaj zespół w kapturze do hodowli tkankowej przez 30 minut, aby komórki się ustabilizowały.
- Umieść macierz z powrotem w dwufunkcyjnym analizatorze komórek i sprawdź kartę Komunikat dla komunikatu Połączenia OK.
- Kliknij przycisk Play, aby rozpocząć pomiar impedancji.
- Kliknij zakładkę Wykres, aby monitorować postęp sygnału.
- Jeśli punkt końcowy zostanie osiągnięty przed 25 godzinami, kliknij krok Przerwij z menu rozwijanego Wykonaj.
- Aby wyeksportować dane, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, wybierz opcję Kopiuj w formacie listy, a następnie wklej dane do arkusza kalkulacyjnego.
nuta: Dane można wyeksportować jako indeks komórki lub indeks komórki delta. Do eksportu można również wybrać informacje o wykresie i/lub układzie.
Tabela 1: Skład pożywki do hodowli komórkowych. W tabeli wymieniono składy pożywek MDA-MD-231, pożywek J2 Fibroblasts, pożywek DCIS i pożywek PDX.
.
| media | Składników | Stężenie/proporcja |
| Nośnik MDA-MD-231 | DMEM (DMEM) | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | 10% |
| J2 Pożywki fibroblastów | DMEM (DMEM) | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | 10% |
| Nośniki DCIS | DMEM F12 | |
| Surowica końska (HS) | 5 proc. |
| Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) | 20 ng/ml |
| insulina | 10 μg/ml |
| Hydrokortyzon | 0,5 μg/ml |
| Toksyna | 100 ng/ml |
| Nośniki PDX | DMEM F12 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | 2 proc |
| HEPESY | 1 mln |
| Insulina Transferyna Selen Etanoloamina (ITS) | 10 μg/ml |
| Hydrokortyzon | 0,5 μg/ml |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | 1 mg/ml |
