Test aktywności syntazy cytrynianu: Test kolorymetryczny do pomiaru aktywności syntazy cytazy mitochondrialnej w homogenacie tkanki Drosophila

Streszczenie

Źródło: Wei, P., et al., A Kolorymetryczny test aktywności syntazy cytrynianu u Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje test kolorymetryczny do pomiaru aktywności syntazy cytrynianu mitochondrialnego obecnego w homogenacie tkankowym Drosophila.

Protokół

1. Test aktywności kolorymetrycznej syntazy cytrynianu dla D. melanogaster

1. Zbierz dziesięć dorosłych much do każdej próbki. Pobrać co najmniej trzy próbki dla każdego genotypu.
2. Przygotuj 500 μl lodowatego buforu ekstrakcyjnego zawierającego 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA i 0,1% trytonu X-100 w probówce o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki.
3. Znieczulić dorosłe muchy CO₂ na podkładce znieczulającej i wyizolować pożądane tkanki. Na przykład, aby odizolować klatkę piersiową dorosłej muchy, przymocuj klatkę piersiową muchy za pomocą kleszczy, a następnie odizoluj odwłoki much, przecinając wzdłuż granicy klatki piersiowej i brzucha za pomocą nożyczek. Zbierz klatkę piersiową muchy do testu aktywności syntazy cytazy mięśni.
   nuta: Na tym etapie określ świeżą masę tkanki, jeśli używasz jej do normalizacji aktywności syntazy cytrynianu.
4. Natychmiast przenieś 10 dorosłych much tułowia do 100 μl lodowatego buforu ekstrakcyjnego i homogenizuj tłuczkiem na lodzie. Aby utrzymać próbki w lodowatym chłodzie, homogenizuj próbki przez 5-10 s na lodzie, a następnie umieść próbki na lodzie przez 5 s i powtarzaj, aż wszystkie tkanki w probówce zostaną całkowicie zhomogenizowane.
   nuta: Zaklej probówkę taśmą, sprawdź homogenaty, aby upewnić się, że nie ma w nich skrzepów i że tkanki w probówce są całkowicie homogenizowane. Wszystkie zabiegi próbkowe powinny być wykonywane na lodzie.
5. Pobrać 10 μl każdej homogenizowanej próbki do nowej probówki w celu pomiaru zawartości białka. Próbki do pomiaru białka należy przechowywać na lodzie.
   nuta: Próbki białka można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy. Stężenia białek służą jako wewnętrzny parametr normalizacji aktywności syntazy cytrynianu.
6. Dodać 400 μl lodowatego buforu ekstrakcyjnego do każdej pozostałej próbki, aby uzyskać całkowitą objętość 500 μl. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół co najmniej 5 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków. Do każdej reakcji dodać 1 μl rozcieńczonego lizatu komórkowego do 150 μl świeżo przygotowanego roztworu reakcyjnego (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetylo-CoA, 1 mM kwas szczawiooctowy). Dokładnie i natychmiast wymieszać, delikatnie pipetując, unikając tworzenia się pęcherzyków. Mierzyć absorbancję przy 412 nm co 10-30 s przez 4 minuty w temperaturze 25 °C za pomocą czytnika płytek zdolnego do pomiaru absorbancji przy 412 nm w minimalnych odstępach czasu 10 s.
   nuta: Wymień końcówkę przed pipetowaniem innego odczynnika i unikaj tworzenia się pęcherzyków w studzienkach. Niepełne wymieszanie odczynników może powodować różnice w pomiarach. Test aktywności syntazy cytrynianu należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej natychmiast po pobraniu próbek, ponieważ test ten służy do ilościowego określenia nienaruszonej masy mitochondrialnej. Bufor reakcyjny powinien być przygotowany bezpośrednio przed użyciem i nie powinien być przechowywany.
7. Wykreśl dane jako gęstość optyczną (OD), absorbancję (abs) (oś Y) w funkcji czasu (w minutach) (oś X). Następnie oblicz nachylenie dla liniowej części krzywej, gdzie szybkość reakcji wynosi
   
   Podziel wartość przez stężenie białka w próbce, aby znormalizować aktywność syntazy cytrynianu. Aktywność syntazy cytrynianu oblicza się jako
   
   nuta: Stężenie białka w próbce można zmierzyć za pomocą zestawu do oznaczania stężenia białka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy (HEPES)	Sigma-Aldrich	V900477
2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol (zasada TRIZMA)	Sigma-Aldrich	V900483
Acetylo-CoA	Sigma-Aldrich	Certyfikat A2181
Kwas ditio-bis-nitrobenzoesowy (DTNB)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8130
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
Szczawiooctan	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy O4126
Tłuczek na pellet	Sangon powiedział:	F619072
Silnik tłuczka do pelletu	Prowincja Tiangen	OSE-Y10
Czytnik płytek	BioTek	eon
Zestaw do oznaczania białek BCA	Beyotime	P0010S
nożyczki	Wskaźnik WPI	Numer katalogowy: 14124
Tryton X-100	Sangon powiedział:	A110694-0100