Test ochrony enzymatycznej oparty na lizostafininie: metoda in vitro do ilościowego określania wewnątrzkomórkowego obciążenia Staphylococcus aureus poprzez selektywne zabijanie bakterii zewnątrzkomórkowych za pośrednictwem enzymów

Streszczenie

Źródło: Rigaill, J. et al. Ulepszony test ochrony enzymatycznej do badania internalizacji Staphylococcus aureus i wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie demonstrujemy test ochrony enzymatycznej in vitro oparty na lizostafinach, aby określić ilościowo internalizację Staphylococcus aureus w komórkach A549. Test pomaga w badaniach jakościowych, ilościowych i charakteryzacyjnych wewnątrzkomórkowego obciążenia bakteryjnego w komórkach gospodarza.

Protokół

1. Inokulacja komórek

1. Zacznij od hodowli ludzkich komórek nabłonkowych A549 w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy z czerwienią fenolową, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) bez antybiotyków.
2. Obserwuj każdą studzienkę 24-dołkowej płytki za pomocą mikroskopii w małym powiększeniu, aby upewnić się, że ludzkie komórki nabłonkowe są zdrowe i rosną zgodnie z oczekiwaniami.
3. Wyjąć i wyrzucić zużytą pożywkę do hodowli komórkowych z płytki 24-dołkowej.
4. Dodać 500 μl zawiesiny bakteryjnej Staphylococcus aureus przygotowanej w DMEM bez czerwieni fenolowej, w celu zaszczepienia do każdej studzienki 100% zlewających się komórek.
5. Inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C i 5% CO₂,
   UWAGA: zaleca się użycie trzech dołków płytki dla każdego badanego stanu (trzykrotnie) i wykonanie co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Opóźnienie inkubacji można dostosować w zależności od celu doświadczalnego.

2. Kwantyfikacja bakterii wewnątrzkomórkowych za pomocą ulepszonego testu ochrony enzymatycznej (iEPA)

1. Przygotuj 7 ml 4x buforu do lizy z 3,5 ml 2% Triton X-100 w sterylnej wodzie i 3,5 ml trypsyny-EDTA.
2. Przygotować roztwór podstawowy lizostafiny o stężeniu 10 mg/ml w buforze octanowym i podwielokrotność 25 μl w kriowialach. Przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
3. Przygotować 250 μl świeżego roztworu roboczego lizostafiny o stężeniu 1 mg/ml, mieszając 25 μl roztworu podstawowego lizostafiny (10 mg/ml) i 225 μl 0,1 M tris-HCl. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 48 godzin.
4. Przygotować 6,25 ml kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną, dodając 6 ml kompletnej pożywki infekcyjnej do 250 μl roztworu roboczego lizostafiny.
5. Do każdej studzienki dodać 250 μl kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną i delikatnie wymieszać płytkę, obracając ją ręcznie.
6. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 36 ± 1 °C w 5% CO_{2 ,} aby lizostafina zabiła bakterie zewnątrzkomórkowe.
7. Pod koniec czasu inkubacji dodać 10 μl proteinazy K w stężeniu 20 mg/ml do każdego dołka w celu inaktywacji lizostafiny.
8. Inkubować komórki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
9. Dodaj 250 μl 4x buforu do lizy, aby lizować komórki przez szok osmotyczny.
10. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 36 ± 1 °C.
11. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół dziesięć razy na dnie studzienki, aby upewnić się, że komórki są w pełni zlizowane i homogenizowane.
12. Użyj automatycznej spiralnej płytki, aby określić obciążenie S. aureus każdej studzienki.
13. Inkubować płytki agarowe przez 18-24 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C.
14. Następnego dnia policz liczbę kolonii za pomocą licznika kolonii, aby obliczyć wewnątrzkomórkowe obciążenie S. aureus każdej studzienki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 24-dołkowa	SOKÓŁ CORNINGA	353047
Linia komórkowa A549	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-185
Roztwór buforowy octanu o pH 4,6	Przywra	Numer katalogowy: 31048	Służy do przygotowania roztworu podstawowego lizostpahiny o stężeniu 10 mg/ml w 20 mM octanu sodu.
AMBICIN (rekombinowana lizostafina)	Technologia AMBI (Niezmienione	Zobacz materiał LSPN-50	Liofilizowana rekomodacyjna lizostafina. Zamrażać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
COS - agar kolumbijski + 5% krwi owczej	Biomérieux	Numer katalogowy: 43049	Zamiast tego można użyć dowolnej płytki agarowej odpowiedniej do uprawy gronkowców.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, wysoka zawartość glukozy z czerwienią fenolową	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D6429
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, wysoka zawartość glukozy bez czerwieni fenolowej	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D1145
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8537
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco z MgCl2 i CaCl2, sterylnie filtrowana	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8662
Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, sterylnie filtrowana	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8537
Rozcieńczony Easyspiral	Nauka międzynarodowa	Numer katalogowy: 414000	Automatyczny rozcieńczalnik i spirala
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10270-106
Proteinaza K, rekombinowana 20 mg/ml	Eurobiografia	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, partia 901727
Skanowanie 4000	Nauka międzynarodowa	Numer telefonu 438000	Automatyczny licznik kolonii
Sterylna woda	OTEC (Międzynarodowa Sieć T	Numer katalogowy: 600500
TC20 Automatyczny licznik komórek	Biorad	1450102	Automatyczny licznik komórek
Tris 1 M pH 8,0	Invitrogen	AM9855G	Służy do przygotowania roztworu roboczego lizostafiny o stężeniu 1 mg/ml w 0,1 M Tris-HCl.
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8787
Trypsyna - roztwór EDTA	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T3924	0,05% trypsyny wieprzowej i 0,02% EDTA w zrównoważonym roztworze soli Hanksa z czerwienią fenolową
Mikroskop fluorescencyjny o szerokim polu	Nikon	Ti2