Test tworzenia cewek stosuje się do oceny aktywności naczyniowej komórek nowotworowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test tworzenia rurek na Matrigelu do oceny aktywności waskulogennej komórek nowotworowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ciągu ostatnich kilku dekad do wykazania aktywności angiogennej komórek śródbłonka naczyniowego in vitro typowo stosowano test tworzenia cewek z użyciem Matrigelu o zredukowanej zawartości czynników wzrostu1-5. Jednakże, narastające dowody z ostatnich lat wykazały, że test ten nie ogranicza się jedynie do badania zachowania naczyniowego komórek śródbłonka. Zamiast tego wykorzystywano go również do badania zdolności wielu typów komórek nowotworowych do wykształcenia fenotypu naczyniowego6-8. Zdolność ta była spójna z ich zachowaniem waskulogenicznym zidentyfikowanym u zwierząt po ksenotransplantacji, procesem znanym jako naśladownictwo waskulogenne (VM)9. Istnieje wiele dowodów wykazujących, że VM indukowane przez komórki nowotworowe odgrywa kluczową rolę w rozwoju nowotworu, niezależnie od angiogenezy komórek śródbłonka6, 10-13. Na przykład stwierdzono, że komórki nowotworowe uczestniczą w tworzeniu unaczynionych, przepływowych kanałów naczyniowych w próbkach tkanek od pacjentów z czerniakiem i glejakiem8, 10, 11. W niniejszej pracy opisaliśmy ten test sieci cewkowych jako przydatne narzędzie w ocenie aktywności waskulogennej komórek nowotworowych. Stwierdziliśmy, że niektóre linie komórkowe nowotworu, takie jak komórki B16F1 czerniaka, komórki U87 glejaka oraz komórki MDA-MB-435 raka piersi, są zdolne do tworzenia cewek naczyniowych; inne natomiast, jak komórki HCT116 raka jelita grubego, nie posiadają tej zdolności. Co więcej, fenotyp naczyniowy jest zależny od liczby komórek wysianych na Matrigel. Zatem test ten może służyć jako potężne narzędzie do przesiewowego badania potencjału naczyniowego różnych typów komórek, w tym komórek naczyniowych, nowotworowych oraz innych.
Protokół
1. Test tworzenia cewek na Matrigelu do oceny aktywności waskulogennej komórek nowotworowych
- Przygotowanie komórek nowotworowych i komórek śródbłonka mikro naczyniowego: komórki nowotworu mózgu, takie jak komórki U87, komórki czerniaka B16F1, komórki raka piersi MDA-MB-435 oraz komórki jelita grubego HCT116, hodowano w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS oraz penicylinę/streptomycynę (wszystkie z Invitrogen). Linia komórek śródbłonka, ludzkie komórki śródbłonka mikro naczyniowego (HMVECs), były hodowane w pożywce EBM2 (Lonza) uzupełnionej o 1 μg/ml hydrokortyzonu i 1 ng/ml epidermal growth factor, 10% FBS oraz penicylinę/streptomycynę. Komórki przemywano PBS trzy razy i odrywano za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA (Invitrogen). Po wirowaniu z prędkością 2,000 rpm przez 5 min osady komórkowe ponownie przemyto PBS. Następnie liczbę komórek w osadzie określono za pomocą hemocytometru.
- Przygotowanie Matrigelu: Alikwot Matrigelu o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (BD Bioscience) ogrzano do temperatury pokojowej. Przed całkowitym rozmrożeniem przeniesiono go na lód i utrzymywano w stanie ciekłym na lodzie przez co najmniej 10 min. Następnie 50 μl Matrigelu naniesiono na płytki 96-dołkowe, utrzymując je w poziomie, co pozwoliło na równomierne rozłożenie Matrigelu, i inkubowano przez 30 min w 37°C.
- Tworzenie cewek: Komórki (1-2 x 104) zawieszono ponownie w bezzserwatkowej pożywce DMEM (dla komórek nowotworowych) lub EBM-2 (dla komórek śródbłonka) i nałożono na wierzch Matrigelu. Jeśli test służył do pomiaru wpływu określonych czynników na rozwój cewek, czynniki te (stymulatory lub inhibitory) dodawano do bezzserwatkowej pożywki. Każda grupa warunkowa obejmowała 4-6 dołków.
- Analiza obrazów i danych: Po inkubacji w 37°C przez noc każdy dołek analizowano bezpośrednio pod mikroskopem. Jeśli wymagana była fiksacja cewek, ostrożnie dodawano 100 μl 10% roztworu formaliny w soli fizjologicznej; po dziesięciu minutach preparat był gotowy do analizy. Pod mikroskopem z kontrastem fazowym (powiększenie 10x) wykonano zdjęcia cewek w każdym polu widzenia, a następnie obliczono średnią liczbę cewek z 3-5 losowo wybranych pól w każdym dołku.
2. Reprezentatywne wyniki:
Komórki HMVECs posłużyły jako kontrola pozytywna, ponieważ cewki te rozwijały się z wyraźnych, wydłużonych ciał komórkowych, które łączą się, tworząc sieć wieloboków. Komórki B16F1, U87 i MDA-MB-435 tworzyły cewki naczyniowe podobne do tych formowanych przez HMVECs, natomiast komórki HCT116 nie wykazały takiej zdolności (Rycina 1). Przebadano zależność tworzenia cewek od dawki komórek w linii U87. Jak pokazano na Rycynie 2, 10 000 komórek tworzyło nieciągłe cewki. Po dwukrotnym zwiększeniu liczby komórek powstała zwarta sieć naczyniowa, porównywalna z tą obserwowaną w HMVECs. Z kolei w przypadku liczby komórek poniżej 5 000 nie udało się uzyskać fenotypu naczyniowego.
Rycina 1. Tworzenie cewek indukowane przez komórki HMVEC, U87, MDA-MB-435 i B16F1,
ale nie przez komórki HCT116. Wszystkie komórki (2 x 104) naniesiono na Matrigel i inkubowano przez noc. Cewki zobrazowano przy użyciu kontrastu fazowego. Komórki HMVEC posłużyły jako kontrola pozytywna. Przedstawiono reprezentatywny obraz z 3-5 pól widzenia. Pasek skali: 100 μm.
Rycina 2. Indukcja tworzenia cewek przez komórki U87 w sposób zależny od liczby komórek. Do tworzenia cewek wykorzystano różną liczbę komórek U87, zgodnie z oznaczeniami w rogach. Komórki HMVEC posłużyły jako kontrola pozytywna. Pasek skali: 100 mm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby zapewnić powodzenie tego testu, należy najpierw sprawdzić jakość Matrigelu. W celu przeprowadzenia testu wstępnego z użyciem HMVECs można pozyskać niewielką próbkę od BD Bioscience. Produkty z różnych partii mogą wykazywać odmienne właściwości, przy czym niektóre serie mogą nie zapewniać optymalnych warunków do tworzenia cewek. Po drugie, należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas nakładania alikwotów Matrigelu do płytek 96-dołkowych, ponieważ pęcherzyki mogą zakłócić proces tworzenia cewek. Jeśli w dołk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez grant NCI R01 CA120659 (RS).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Matrigel o zredukowanej zawartości czynników wzrostu | BD Biosciences | 47743-720 | |
| Zestaw EBM2 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Mikroskop Nikon ECLIPSE TS100 | Nikon Instruments |
Bibliografia
- Shao, R., Guo, X. Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis. Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).
- Ribeiro, M. J. Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium. Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).
- Ades, E. W. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).
- Shao, R. Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression. Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).
- Shao, R. YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).
- Basu, G. D. A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells. Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).
- Scavelli, C. Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma. Oncogene. 27, 663-674 (2008).
- El Hallani, S. A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry. Brain. 133, 973-982 (2010).
- Maniotis, A. J. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).
- Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).
- Folberg, R. Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns. American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).
- Liu, C. Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors. Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).
- Sood, A. K. The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy. Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).
- Shirakawa, K. Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft. Cancer Research. 62, 560-566 (2002).
- Ruf, W. Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry. Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).
- Seftor, R. E. Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma. Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).
- Shirakawa, K. Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer. International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
