$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE
.
1. Przygotowanie roztworu
UWAGA: Proszę obchodzić się ze wszystkimi odczynnikami i roztworami za pomocą szkła bez żelaza lub jednorazowego plastiku. Nie dopuszczaj do kontaktu metalowych materiałów laboratoryjnych (np. szpatułek ze stali nierdzewnej) z jakimkolwiek odczynnikiem lub roztworem, ze względu na ryzyko zanieczyszczenia żelazem. Upewnij się, że wszelkie naczynia szklane wielokrotnego użytku nie zawierają żelazka. Umyć materiały odpowiednim detergentem laboratoryjnym przez 30-60 min, spłukać wodą dejonizowaną, namoczyć przez noc w 37% roztworze kwasu azotowego rozcieńczonym 1:3 wodą dejonizowaną, ponownie spłukać wodą dejonizowaną i pozostawić do wyschnięcia.
- Mieszanina kwasów: Dodać 10 g kwasu trichlorooctowego do 82,2 ml 37% kwasu solnego w szklanej butelce, dokładnie rozpuścić i dostosować końcową objętość do 100 ml wodą dejonizowaną. Wstrząśnij przed użyciem. Alternatywnie, użyj tylko 37% kwasu solnego do trawienia tkanek.
nuta: Roztwór jest stabilny przez co najmniej 2 miesiące, gdy jest przechowywany w ciemnobrązowych szklanych butelkach z odczynnikami.
ostrożność: Kwas solny i kwas trichlorooctowy są, a skoncentrowane formy uwalniają toksyczne kwaśne opary. Podczas pracy z kwasami należy nosić odzież ochronną, rękawice odporne na chemikalia i okulary przeciw rozpryskom chemikaliów. Unikaj ich wdychania i zawsze dotykaj kwasów pod wyciągiem.
- Nasycony octan sodu: Dodaj 228 g bezwodnego octanu sodu do 400 ml wody dejonizowanej w szklanej butelce i mieszaj przez noc w temperaturze pokojowej. Pozwól roztworowi odpocząć i wytrącić się przez jeden dzień. Jeśli nie wystąpi wytrącanie się, kontynuuj dodawanie niewielkich ilości octanu sodu. Roztwór należy przechowywać w szklanej butelce.
- Odczynnik chromogenowy: Aby przygotować 1 ml odczynnika chromogenowego, dodać 1 mg soli disodowej kwasu 4,7-difenylo-1,10-fenantrolinowego do 500 μl wody dejonizowanej i 10 μl stężonego (100%) kwasu tioglikolowego i dokładnie rozpuścić. Uzupełnić końcową objętość do objętości 1 ml wodą dejonizowaną.
nuta: Przygotuj tyle odczynnika chromogenowego, ile potrzeba. Roztwór jest stabilny przez 1 miesiąc, gdy jest chroniony przed światłem.
- Roboczy odczynnik chromogenowy (WCR): Dodaj 1 objętość odczynnika chromogenowego do 5 objętości nasyconego octanu sodu i 5 objętości wody dejonizowanej.
nuta: Roztwór ten należy przygotować na świeżo w dniu użycia.
- Podstawowy roztwór wzorcowy żelaza: Aby przygotować 20 mM podstawowego roztworu żelaza, umieść 111,5 mg proszku karbonylowo-żelazowego w kolbie miarowej o pojemności 250 ml zawierającej 5,480 μl 37% kwasu solnego. Pozostaw do rozpuszczenia na noc w temperaturze pokojowej (lub inkubuj we wrzącej łaźni wodnej). Następnie uzupełnić roztwór do końcowej objętości 100 ml wodą dejonizowaną.
nuta: Roztwór wzorcowy może być przechowywany przez czas nieokreślony, jeśli jest przechowywany w szczelnie zamkniętym naczyniu.
- Roboczy roztwór wzorcowy żelaza (WISS): Dodać 13,5 μl 37% kwasu solnego do 500 μl wody dejonizowanej. Dodać 10 μl podstawowego roztworu wzorcowego żelaza i uzupełnić końcową objętość do 1 ml wodą dejonizowaną (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; mierzone za pomocą AAS).
nuta: Roztwór roboczy należy przygotować na świeżo w dniu użycia.
2. Suszenie próbki
- Wytnij próbkę tkanki o wadze 10-100 mg za pomocą ostrza skalpela. Zważ go dokładnie na wadze analitycznej/precyzyjnej na małym kawałku parafilmu (świeża masa).
- Za pomocą plastikowej pęsety umieść kawałek chusteczki na 24-dołkowej płytce (bez pokrywki, aby umożliwić odparowanie wody) i pozostaw do wyschnięcia w standardowym inkubatorze w temperaturze 65 °C przez 48 godzin.
- Alternatywnie można użyć laboratoryjnej kuchenki mikrofalowej do wytrawiania próbek tkanek. Za pomocą plastikowej pęsety umieść zważony kawałek chusteczki w teflonowym kubku bez żelazka i wysusz go w kuchence mikrofalowej. Ustaw parametry pracy zgodnie z instrukcją obsługi przyrządu.
nuta: Jako odniesienie, parametry operacyjne suszenia próbek wątroby przy użyciu specjalnego pieca do wytrawiania (zob. tabela materiałów) przedstawiono w tabeli 1.
- Za pomocą plastikowej pęsety umieść każdy wysuszony kawałek tkanki na małym kawałku parafilmu wewnątrz wagi analitycznej/precyzyjnej i dokładnie go zważ (sucha masa).
3. Kwaśne trawienie próbki
- Za pomocą plastikowej pęsety przenieś każdy wysuszony kawałek tkanki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Dodać 1 ml mieszaniny kwasów i zamknąć probówkę mikrowirówki. Przygotuj ślepą próbę kwasową w ten sam sposób, z wyjątkiem tego, że tkanka jest pominięta.
ostrożność: Mieszanina kwasów jest i uwalnia toksyczne opary. Podczas pracy z mieszaniną kwasów należy nosić odzież ochronną, rękawice odporne na chemikalia i okulary ochronne przed rozpryskami chemikaliów. Unikaj wdychania go i zawsze obchodź się z nim pod wyciągiem.
- Trawić tkanki przez inkubację probówek do mikrowirówek w inkubatorze w temperaturze 65 °C przez 20 godzin.
- Po schłodzeniu do temperatury pokojowej przenieść 500 μl klarownego (żółtego) ekstraktu kwasowego (supernatantu) do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety wyposażonej w plastikowe końcówki. Jeżeli nie jest możliwe uzyskanie klarownego supernatantu, należy przeprowadzić krótkie wirowanie wirowania.
ostrożność: Supernatant jest silnie kwaśny. Podczas pracy z supernatantami należy nosić odzież ochronną, rękawice odporne na chemikalia i okulary ochronne przed rozpryskami substancji chemicznych. Zawsze należy obchodzić się z nimi pod wyciągiem.
nuta: W tym momencie ekstrakty kwasowe mogą być natychmiast użyte do testu kolorymetrycznego lub zamrożone w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Całkowicie rozmrozić zamrożone próbki do temperatury pokojowej i zawirować je przed użyciem.
4. Rozwój kolorów
- Przygotować reakcje chromogenowe, jak wskazano w tabeli 2, w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml lub, w celu zwiększenia przepustowości, bezpośrednio do płaskiego, 96-dołkowego, przezroczystego, nieobrobionego mikropłytki polistyrenu. Przygotować wszystkie reakcje (ślepa próba kwasowa, wzorzec i próbka) co najmniej dwukrotnie.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
5. Odczyt absorbancji
- Zmierzyć absorbancję próbki w spektrofotometrze lub czytniku płytek przy długości fali 535 nm w stosunku do wody odniesienia dejonizowanej. Tabliczki można odczytywać bez pokrywy lub z pokrywką. W obudowie z pokrywą usuń kondensację powstałą w wyniku uwolnienia oparów kwasu z pokrywy tuż przed pomiarem, aby uniknąć możliwych zakłóceń w odczycie absorbancji.
nuta: Absorbancja optyczna ślepej próby kwasowej odczytanej w stosunku do wody dejonizowanej (odniesienie) powinna być mniejsza niż 0,015; Absorbancja optyczna wzorca i próbek powinna wynosić od 0,100 do 1,000. W przypadku próbek o bardzo wysokiej lub bardzo niskiej zawartości żelaza może być konieczne dostosowanie objętości ekstraktu kwasowego (supernatantu) i diH2O (tabela 2): jeżeli absorbancja jest większa niż 1,0, należy użyć mniejszej objętości próbki (supernatantu); Gdy absorbancja jest mniejsza niż 0,1, należy użyć większej objętości supernatantu. Objętość próbki (Vsmp) jest brana pod uwagę przy obliczaniu zawartości żelaza w tkankach każdej próbki (patrz krok 6).
6. Obliczanie zawartości żelaza w tkankach
- Oblicz zawartość żelaza w tkankach niehemowych za pomocą następującego równania:
Żelazo tkankowe (μg/g suchej tkanki) = równanie 1
AT = absorbancja badanej próbki
AB = absorbancja ślepej próby kwasu
AS = absorbancja wzorca
Fes = stężenie żelaza w WISS (μg Fe/ml)
W = masa suchej tkanki (g)
Vsmp = objętość próbki (zmienna objętość supernatantu w tabeli 2 przeliczona na ml)
Vf = końcowa objętość mieszaniny kwasów po całonocnej inkubacji w temperaturze 65 °C (odpowiadająca objętości kwasu plus objętości suchej tkanki w ml; jeżeli masa próbki nie różni się znacząco, przyjąć stałą objętość ≈ 1 ml)
Vstd = standardowa objętość żelaza (objętość WISS w tabeli 2 przeliczona na ml)
Vrv = końcowa objętość reakcyjna (całkowita objętość w tabeli 2 przeliczona na ml)
Tabela 1: Parametry operacyjne suszenia wątroby w kuchence mikrofalowej do wytrawiania używane tutaj
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
| Moc 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | Rozdział 30 |
| Ciśnienie (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Czas (min): | 10 | 15 | Rozdział 30 | Rozdział 30 | Rozdział 40 |
| Czas przy ciśnieniu (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| wentylator: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabela 2: Przygotowanie reakcji chromogenowych w probówkach 1,5 ml lub płytkach 96-dołkowych.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
pkt.
pkt.
szt.
pkt.
pkt.
szt.
| | WCR (μl) | Mieszanina kwasów (μL) | Supernatant (μl) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Całkowita objętość (μL) |
| 1,5 ml probówek | Ślepa próba kwasowa | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| norma | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| próbka | 1000 | | zmienna | | zmienna | 1300 |
| 96-dołkowa mikropłytka | Ślepa próba kwasowa | 150 | 22,5 | | | 22,5 | Rozdział 195 |
| norma | 150 | 22,5 | | 22,5 | | Rozdział 195 |
| próbka | 150 | | zmienna | | zmienna | Rozdział 195 |