$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Ekspansja przodków OC
- Zawiesić PBMC w pełnym α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% amfoterycyna B) zawierającym 20 ng/mL M-CSF. Nasiona PBMC o gęstości 2,5 x 105 komórek/cm2. Zwykle komórki wyizolowane z 15-20 ml świeżej krwi można wysiać w jednej kolbie o długości 75cm2 (1,5-2 x 107 komórek).
- Karmić komórki świeżym, kompletnym α-MEM zawierającym 20 ng/mL M-CSF co trzeci dzień, aż przyłączone komórki osiągną pożądane zbieganie. Typowa wydajność to 1,5-2 x106 komórek/kolbę, gdy komórki są w 95% zlewne. Zazwyczaj okres ekspansji trwa 6 dni.
nuta: Potencjał osteoklastogenny prekursorów może zmniejszać się wraz z wydłużeniem czasu uprawy.
2. Indukcja osteoklastogenezy na płytkach pokrytych fosforanem wapnia
- Aby ułatwić adhezję komórek, należy inkubować płytki pokryte fosforanem wapnia (CaP) z 50 μl FBS przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- W celu odłączenia prekursorów OC należy dwukrotnie przemyć kolbę PBS w celu usunięcia martwych lub nieprzylegających komórek. Dodać 4 ml trypsyny (tabela materiałów) na 75 cm2 kolbę, przez 30 minut.
- Dodać 4 ml kompletnego α-MEM, aby zatrzymać trawienie, ostrożnie odłączyć komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml.
- Określ całkowitą liczbę komórek za pomocą komory Neubauera lub podobnej.
- Osadzać komórki przez wirowanie przez 7 minut przy 350 x g. Ponownie zawiesić osad w wystarczającej ilości kompletnego α-MEM zawierającego 20 ng / mL M-CSF i 20 ng / ml RANKL, aby uzyskać stężenie 1 x 106 komórek / ml.
- Odessać roztwór FBS z 96-dołkowej płytki pokrytej CaP i odpipetować 200 μl zawiesiny komórek na dołek (2 x 10 5 komórek/dołek).
- Inkubować prekursory OC przez pożądany okres czasu lub z użyciem pożądanych odczynników istotnych dla projektu doświadczalnego. Zazwyczaj dużą liczbę dużych i wielojądrowych OC można zaobserwować po 6 dniach i gdy tworzą się doły resorpcyjne. Karmić komórki świeżą, kompletną pożywką α-MEM zawierającą 20 ng/mL M-CSF i 20 ng/ml RANKL co trzeci dzień.
- Pod koniec inkubacji dwukrotnie przemyć komórki PBS, utrwalić 4% paraformaldehydem przez 10 minut i ponownie przemyć PBS.
- Utrwalone OC należy stosować bezpośrednio do barwienia fluorescencyjnego lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Barwienie fluorescencyjne OC i powłoka fosforanu wapnia
- Inkubować utrwalone komórki z buforem permeabilacyjnym (0,1% Tryton w PBS) przez 5 minut.
- Zabarwić filamenty aktynowe 100 μl roztworu falloidyny znakowanego AlexaFluor 546 w PBS przez 30 minut i odessać roztwór barwiący. Dodać 100 μl roztworu barwiącego Hoechst 33342 (10 μg/ml w PBS) przez 10 minut, aby wybarwić jądra. Można również użyć DAPI.
- Zabarwić powłokę CaP 100 μL 10 μM kalceiny w PBS przez 10 minut. Umyć trzykrotnie PBS i zrobić zdjęcia.