Test utleniania substratu w hodowanych komórkach: Test in vitro do ilościowego określania utleniania substratu w komórkach poprzez pomiar sygnałów radioaktywnych z uwięzionego CO2

Streszczenie

Źródło: Song, C. et al., Ocena utleniania substratów energetycznych in vitro z pułapkowaniem ¹⁴CO₂. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje technikę kwantyfikacji CO₂ uwalnianego podczas utleniania substratu przy użyciu ¹⁴substratów znakowanych radioizotopem C. Uwolnione ¹⁴CO₂ jest uwięzione w roztworze alkalicznym i oznaczane ilościowo za pomocą licznika scyntylacyjnego. Utlenianie różnych substratów różni się w zależności od tkanki i odzwierciedla stan patofizjologiczny tkanki.

Protokół

Użycie materiałów radioaktywnych (RAM) wymaga uprzedniej zgody wyznaczonego komitetu ds. bezpieczeństwa w każdej instytucji.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych dla ¹⁴substratów znakowanych znakiem C

1. Przygotować 4 mM roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA), mieszając 11 g BSA i 33,1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco i delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez ~ 3 godziny, aż do całkowitego rozpuszczenia BSA. Przed użyciem podgrzać roztwór podstawowy BSA w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C.
2. Suszyć na powietrzu 50 μCi ¹⁴C-oleinian (50 μCi/μmol w etanolu) w fiolce ze zdjętą pokrywką przez 8 godzin w przeznaczonym do tego celu okapie roboczym RAM. Dodać 312,5 μl_H2O, a następnie 3,5 mg (11,5 μmol) oleinianu sodu. Dokładnie wymieszaj.
3. Podgrzej powstały roztwór do temperatury 70 °C w łaźni wodnej. Dodać 0,9375 ml podgrzanego roztworu podstawowego BSA, aby otrzymać 10 mM gorącego roztworu podstawowego oleinianu (zawierającego stosunek ¹⁴C-oleinianu do nieznakowanego oleinianu w stosunku 1:11,5). Podwielokrotnić roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.
4. ^{Stosować 14}C-glukozę i ¹⁴C-glutaminę bezpośrednio po rozmrożeniu.

2. Przygotowanie podłoża zawierającego ¹⁴substratów znakowanych C

UWAGA: Aby zapewnić wiarygodne stężenie substratów energetycznych w mediach, należy używać niestandardowych nośników z nowymi substratami dodanymi na krótko przed użyciem. W tym przypadku stosuje się wykonane na zamówienie minimum niezbędne podłoże (MEMα) bez glukozy, pirogronianu, glutaminy, czerwieni fenolowej lub wodorowęglanu sodu. Jednak dla każdego typu komórki należy określić optymalne podłoże.

1. Rozpuścić 8,67 g pożywki w proszku w 1 l oczyszczonej wody. Dodać 2,2 g wodorowęglanu sodu, aby osiągnąć pH 7,4 i przefiltrować roztwór za pomocą filtracji próżniowej 0,22 μm.
2. Dodaj świeże składniki, aby uzyskać kompletną pożywkę (cMEMα) o końcowych stężeniach 5,5 mM glukozy, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Dalej uzupełnij cMEMα o 100 mM L-karnityny i 10 μM HEPES, aby ułatwić utlenianie kwasów tłuszczowych.
3. Bezpośrednio przed użyciem dodaj ¹⁴substratów znakowanych C do świeżo przygotowanego cMEMα, aby uzyskać gorącą pożywkę. Aby uzyskać gorącą pożywkę oleinianową, dodać 10 mM gorącego roztworu podstawowego oleinianu do cMEMα, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM oleinianu (rozcieńczenie 1:100, radioaktywność końcowa 0,4 μCi/ml).
   nuta: Gorący oleinian o sile 10 mM zawierający stosunek gorącego i zimnego oleinianu 1:11,5 (patrz krok 1.3) stosuje się w celu osiągnięcia fizjologicznego poziomu 100 μM całkowitego oleinianu w pożywce przy jednoczesnej minimalizacji ilości materiału radioaktywnego.
4. Przygotować 10 mM nieoznakowanego wywaru oleinianowego, dodając 24,36 mg oleinianu sodu do 2 ml_H2Ow łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez ~20 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia, a następnie szybko wymieszać z 6 ml 4 mM roztworu podstawowego BSA podgrzanego wstępnie do 70 °C. Przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 godzinę i przefiltrować przez filtr 0,22 μm. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.
5. Aby uzyskać gorącą pożywkę glukozy, dodaj ¹⁴C-glukozy do końcowego stężenia 1,333 μM (rozcieńczenie 1:4,125, końcowa radioaktywność 0,4 μCi/ml). Aby uzyskać gorącą pożywkę glutaminy, dodaj ¹⁴C-glutaminy do końcowego stężenia 2 μM (rozcieńczenie 1:1000, radioaktywność końcowa 0,4 μCi/ml).
6. Uzupełnij gorącą pożywkę glukozy i glutaminy 10 mM roztworem podstawowym nieznakowanego oleinianu z kroku 2.4, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 μM oleinianu, takie samo jak w gorącym pożywce oleinianowej.

3. Przygotowanie komórek

UWAGA: Preosteoblasty kalwaryjne i makrofagi szpiku kostnego są tutaj używane jako przykłady. Użytkownicy powinni przygotować wybrany typ ogniwa zgodnie z odpowiednimi protokołami. Zoptymalizuj stężenie kolagenazy II do wykorzystania do trawienia w eksperymentach pilotażowych, ponieważ aktywność enzymatyczna może się różnić w zależności od partii.

1. Izolacja i hodowla preosteoblastów kalwarycznych
   1. Uśmierc młode w 3-5 dniu po urodzeniu (P3-5) przez ścięcie głowy i przenieś je do lodowatego DPBS zawierającego penicylinę-streptomycynę (P/S).
   2. Odsłoń kalwarię, usuwając skórę i tkankę miękką. Zbierz środkowy obszar, odcinając otaczające tkanki od tyłu do przodu w DPBS (ryc. 1A). Delikatnie podrap wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię kalwarii za pomocą pęsety, aby pomóc uwolnić komórki po późniejszym trawieniu.
   3. Przygotować roztwór kolagenazy typu II o stężeniu 2 mg/ml i 4 mg/ml w DPBS i przefiltrować każdy roztwór świeżym filtrem 0,22 μm. Oczyszczoną kalwarię należy najpierw roztrawić roztworem kolagenazy o stężeniu 2 mg/ml przez 15 minut, a następnie wyrzucić roztwór wytrawiający. Oczyste próbki należy roztrawić w roztworze kolagenazy o stężeniu 4 mg/ml 3 razy przez 15 minut za każdym razem, łącząc i oszczędzając roztwór do wytrawiania.
   4. Przefiltrować roztwór wytrawiający przez sitka komórkowe o wielkości 70 μm i odwirować filtrat o stężeniu 300 × g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w cMEMα (patrz krok 2.2) zawierający 10% FBS i P/S.
   5. Policz i zasiej komórki na 4 × 10⁴ komórkach/cm² w 10 cm płytkach. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 3 dni.
   6. Dysocjuj komórki w temperaturze 37 °C za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA. Policz i zasiej komórki na 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych z cMEMα zawierającym 10% FBS i P/S w temperaturze 7,5 × 10⁵/^cm2. Wysiewać co najmniej 4 dołki na każdy typ komórki na substrat i co najmniej trzy dodatkowe studzienki dla każdego typu komórek w celu zliczenia komórek przed testem.
   7. Hodować komórki w temperaturze 37 °C przez noc przed testami utleniania substratu.
2. Izolacja i hodowla BMM
   UWAGA: Hodowla BMM wymaga czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), który można kupić na rynku jako białko rekombinowane. Kondycjonowana pożywka z linii komórkowej CMG14-12 zaprojektowana do ekspresji M-CSF jest ekonomiczną alternatywą zastosowaną w tym przypadku.
   1. Zbierz kości udowe i piszczelowe od 8-tygodniowych myszy po usunięciu mięśni i tkanki łącznej. Wytnij i wyrzuć oba końce kości ostrymi nożyczkami.
   2. Wypłukać szpik kostny z jednej kości udowej i jednej kości piszczelowej na 10-centymetrową szalkę Petriego za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę 23 G zawierającą 15 ml cMEMα z 10% FBS, P/S i 10% pożywką kondycjonowaną CMG14-12 (pożywka BMM). Wyhodować komórki na szalce Petriego w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   3. Po 3 dniach wyrzuć pożywkę hodowlaną i spłucz DPBS. Dysocjuj przyłączone komórki w temperaturze 37 °C za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 minut. Odwirować i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce BMM.
   4. Policzyć i wysiać komórki na 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych w temperaturze 7,5 × 10⁵/^cm2 w taki sam sposób, jak opisano w ppkt 3.1.6. Hodowla w temperaturze 37 °C przez noc w pożywce BMM przed rozpoczęciem testów.

4. Test utleniania substratu z pułapką CO₂

UWAGA: Odpowiednia gęstość wysiewu powinna być określona dla każdego typu komórki, aby osiągnąć 80-90% konfluencji przed rozpoczęciem testu. Należy pamiętać, że gęstość komórek może wpływać na stan metaboliczny komórek.

1. Umyj komórki w dodatkowych studzienkach dwukrotnie za pomocą DPBS. Zdysocjuj komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i zmieszanych komórek o pojemności 20 μl zawieszonych w DPBS z 20 μl gotowego do użycia komercyjnego roztworu barwnika oranż akrydynowy / jodku propydyny (AO / PI). Określ liczbę aktywnych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i zapisz liczbę do końcowych obliczeń.
2. Umyć komórki w studzienkach testowych dwukrotnie za pomocą DPBS. Dodać 500 μl gorącej pożywki do każdego dołka testowego w kapturze do hodowli tkankowych wyznaczonym przez RAM. Uszczelnić płytki parafilmem i inkubować komórki w inkubatorze wyznaczonym do stosowania w pamięci RAM w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
3. Podczas inkubacji pociąć bibułę filtracyjną na okrągłe kawałki nieco większe niż obszar wewnątrz nasadki probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i włożyć papier ciasno do nasadki (rysunek 1B). Dodać 200 μl 1 M kwasu nadchlorowego do każdej probówki i 20 μl wodorotlenku sodu do bibuły filtracyjnej umieszczonej wewnątrz nakrętki.
4. Po inkubacji komórek przenieść 400 μl pożywki hodowlanej z każdej studzienki do przygotowanych probówek i natychmiast zamknąć nakrętki. Pozostaw probówki w stojaku na probówki w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
5. Podczas inkubacji należy ustawić fiolkę scyntylacyjną dla każdej probówki i napełnić ją 4 ml płynu scyntylacyjnego. Przenieść każdy kawałek bibuły filtracyjnej do fiolki scyntylacyjnej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
6. Wykonaj testy wycierania okapu do hodowli tkankowej, łaźni wodnej (używanej do przygotowania ¹⁴oleinianów C), lodówki, inkubatora, zlewu, ziemi i dowolnego innego obszaru roboczego pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia pamięci RAM. Chusteczki papierowe należy włożyć do fiolek scyntylacyjnych zawierających płyn scyntylacyjny.
7. Zmierzyć ^{radioaktywność 14}C w fiolkach scyntylacyjnych za pomocą licznika scyntylacyjnego. Zapisz wyniki odczytu. W razie potrzeby należy odkazić środowisko pracy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego.

Wyniki

Rysunek 1: Schematy testu pułapkowania CO₂ i rozwarstwienia kalwarii. (A) Środkowy obszar kalwarii, oznaczony pomarańczowym przerywanym trójkątem, jest zbierany w celu izolacji komórek. (B) Do wychwytywania CO₂ stosuje się probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml (etap 1). Bibuły filtracyjne (niebieski papier w celach ilustracyjnych) są cięte tak...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtry 0,22 μm	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Służy do filtrowania roztworu BSA
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco (firma Gibco)	25200056	Oddziel komórki od hodowli komórkowej Płyty
Probówki Eppendorfa 1,5 ml	PR1MA	PR MCT17 RB	Służy do inkubacji reakcji
Talerze 10 cm	TPP (TPP)	Numer katalogowy 93100	Używany do hodowli komórkowych
Strzykawka 10 ml	Bd	302995	Służy do płukania szpiku z długiego Kości
10% FBS	Leki biologiczne w Atlancie	Zobacz materiał S11550	Do przygotowania pożywki do hodowli komórkowych
14C -Glukoza	PerkinElmer powiedział:	NEC042X050UC	Służy do wytwarzania gorących mediów
14 C-glutamina	PerkinElmer powiedział:	NEC451050UC	Służy do wytwarzania gorących mediów
14 C-oleinian	PerkinElmer powiedział:	NEC317050UC	Służy do wytwarzania gorących mediów
Igła 23 G	Bd	Numer katalogowy: 305120	Służy do płukania szpiku z długiego Kości
Płytki 24-dołkowe	TPP (TPP)	Numer katalogowy: 92024	Używany do hodowli komórkowych
Sitka do komórek 70 μm	MIDSCI	70OGNIWO	Służy do filtrowania supernatantu podczas trawienie kawaryjne
Oranż akrydynowy/Jodek propidyny Barwnik (AO/PI)	Nauki biologiczne Nexcelom	Dokument CS2-0106	Barwi żywe komórki w celu określenia seed gęstość
Surowica bydlęca Ablumin	Proliant biologiczny	Numer katalogowy: 68700	Służy do koniugacji kwasów tłuszczowych
Celometr Auto 2000	Nauki biologiczne Nexcelom		Określ liczbę żywotnych komórek
wirówka	Rybak termiczny	Legendarny Micro 21R	Służy do granulowania ogniw
Kolagenaza typu II	Worthington	LS004176	Oddziel komórki od tkanki
Niestandardowa alfa MEM	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	Kod produktu: ME 18459P1	Służy do tworzenia niestandardowych gorących nośników
Dulbecco's Fosforany buforowany Słony	Gibco (firma Gibco)	10010023	Służy do rozpuszczania i rozcieńczania odczynników, i umyj naczynia z kulturami
Bibuła filtracyjna	Millipore-Sigma	WHA1001090	Wychwyty CO 2 wodorotlenkiem sodu
glukoza	Sigma-Aldrich	G7528	Służy do tworzenia niestandardowych multimediów
HEPESY	Gibco (firma Gibco)	15630080	Wychwytuje CO 2 podczas hodowli komórkowej
L-karnityna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C0283	Uzupełniony do utleniania kwasów tłuszczowych
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	Służy do tworzenia niestandardowych multimediów
MEM alfa	Thermo	A10490	Pożywka do hodowli komórkowych
Parafilm	Opakowania plastikowe Pecheney	Zobacz materiał PM998	Służy do uszczelniania naczyń do hodowli komórkowych
Penicylina-Streptomycyna	Rybak termiczny	15140122	Zapobiega zanieczyszczeniu w kulturze komórkowej
Kwas nadchlorowy	Sigma-Aldrich	244252	Uwalnia CO 2 podczas przemiany materii Test
Pirogronian	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P5280	Służy do tworzenia niestandardowych multimediów
Licznik scyntylacyjny	Beckman Coulter	Zobacz materiał LS6500	Określa radioaktywność na podstawie Bibuła filtracyjna
Płyn scyntylacyjny	MP Biomedycyna	882453	Pochłaniaj energię emitowaną przez pamięci RAMs i ponownie emitować je w postaci błysków światła
Fiolka scyntylacyjna	Fisher Naukowy	03-337-1	Pojemniki reakcyjne do scyntylacji płyn
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S5761	Bufor bilansowy dla pożywki
wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 58045	Wychwytuje CO2 podczas testu metaboilc
Oleinian sodu	Santa Cruz	SC-215879	Sprzężony kwas tłuszczowy BSA preparat
Filtracja próżniowa 1000	TPP (TPP)	Numer katalogowy 99950	Filtr cMEMα

powiedział: powiedział: powiedział: