$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE
.
1. Przygotowanie LED do oświetlenia światłem niebieskim
- Włącz panel LED za pomocą powiązanej aplikacji zainstalowanej na tablecie/telefonie. Umieść sondę spektrometru w pustej studzience 6-dołkowej naczynia i dostosuj światło LED do długości fali, osiągając szczyt na ~ 456 nm za pomocą aplikacji. Umieść czujnik optyczny miernika mocy optycznej w pustej studzience i wyreguluj moc światła LED (~0.61 mW/cm2). Ustawienie oświetlenia LED można zapisać i można je odzyskać w aplikacji.
- Wprowadzić ustawienie naczynia/panelu LED do inkubatora w temperaturze 28 °C. Zakończ ten krok, zanim rozpocznie się obrazowanie ryb przy 48 hpf.
2. Obrazowanie larw danio pręgowanego wyrażających optogenetyczną TDP-43
- Wybierz podwójnie transgeniczne ryby Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] podwójnie transgeniczne ryby co najmniej przed 47 hpf, na podstawie fluorescencji RFP (opTDP-43h) lub EGFP (EGFP-TDP-43z) w kręgosłupowym kręgosłupie ruchowym za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę obiektywową Plan-Neofluar 5x/0,15.
- Dechorionacja podwójnie transgenicznych ryb Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
- Rozgrzej 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia zawierającą 250 μg/ml soli metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu w temperaturze 42 °C.
- Krótko znieczulić podwójnie transgeniczne ryby Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] podwójnie transgeniczne ryby w temperaturze 48 hpf w buforze E3 zawierającym to samo stężenie trikanu.
- Umieść kroplę podgrzanej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia na szklanym naczyniu w temperaturze pokojowej. Średnica kropli agarozy w kształcie kopuły na szklanym naczyniu wynosi 8-10 mm.
- Za pomocą pipety Pasteura dodaj znieczuloną rybę do agarozy o niskiej temperaturze topnienia na szklanym naczyniu, a następnie wymieszaj, pipetując kilka razy. Zminimalizuj ilość buforu E3 dodawanego do agarozy wraz z rybą.
- Utrzymuj rybę na boku, używając igły strzykawkowej podczas krzepnięcia agarozy (zwykle ~1 min), aby upewnić się, że rdzeń kręgowy znajduje się w odpowiedniej pozycji poziomej. Po zestaleniu się umieść kilka kropli buforu E3 na rybę w kształcie kopuły zamontowaną na agarozie.
- Uzyskaj szeregowe konfokalne przekroje z rdzenia kręgowego, skanując za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę obiektywową z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie o aperturze numerycznej 1,00, przy użyciu prędkości skanowania 4,0 μs na piksel (12 bitów na piksel), wielkości kroku 1,0 μm na wycinek dla obiektywu oraz kombinacji długości fal wzbudzenia/emisji: Kanał 1) 473/510 nm dla EGFP i kanał 2) 559/583 nm dla mRFP1.
nuta: Kloaka po brzusznej stronie ryby jest zawarta w regionach zainteresowania (ROI) jako odniesienie, co pomaga zidentyfikować i porównać segmenty kręgosłupa (poziomy 16-17) w różnych punktach czasowych.
- Usuń rybę z agarozy, ostrożnie rozbijając agarozę igłą strzykawki, jak tylko obrazowanie zostanie zakończone. Utrzymuj jak najkrótszy czas, w którym ryba jest osadzona w agarozie, chociaż osadzanie agarozy przez <30 minut nie wpływa na żywotność ryby.
3. Stymulacja światłem ryb wyrażających opTDP-43h poprzez oświetlenie pola niebieskiej diody elektroluminescencyjnej (LED)
- Dodaj 7,5 ml buforu E3 do studzienki i umieść w studzience podwójnie transgeniczne ryby Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]. Umieść sześciodołkowe naczynie na panelu LED, trzymając naczynie i panel LED w odległości 5 mm od siebie za pomocą przekładki (na przykład z pięcioma przesuwanymi szklankami ułożonymi jeden na drugim).
- Włącz niebieską diodę LED. Trzymaj część podwójnie transgenicznych ryb Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] podwójnie transgenicznych ryb w oddzielnym sześciodołkowym naczyniu pokrytym folią aluminiową, gdy konieczne są nieoświetlone ryby kontrolne (tj. w ciemnych warunkach).
- Po naświetleniu (np. przez 24 godziny przy 72 hpf na rysunku 1) zobrazuj rdzeń kręgowy oświetlonej ryby, powtarzając kroki 2.3 - 2.9.
