Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE
.
1. Badanie in vitro małych cząsteczek
- Przygotuj płytki testowe, wykonując poniższe czynności.
- Wlać autoklawowaną wodę destylowaną do sterylnego koryta i za pomocą pipety wielokanałowej dozować 40 μl wody destylowanej z koryta do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.
- Przygotuj narzędzie do przypinania i dodaj chemikalia.
- Ustaw tace na kołki (patrz tabela materiałów) w pobliżu płomienia palnika Bunsena na stole laboratoryjnym. Do kolejnych tacek na szpilki dodaj następujące ilości: 25 ml roztworu do czyszczenia szpilek, 35 ml 50% DMSO (w wodzie), 45 ml wody destylowanej, 55 ml 70% EtOH i 65 ml 95% EtOH. Umieść po jednym kawałku bibuły przed każdą tacą.
- Wyczyść narzędzie do przypinania, zanurzając kołki w roztworze czyszczącym i przesuwając kołki w górę iw dół trzy razy (3x) w roztworze. W tym protokole "3x" i "10x" są zdefiniowane jako przesuwanie pinnera w górę i w dół w roztworze odpowiednio trzy lub dziesięć razy. Osusz szpilki na bibułce. Powtórz tę procedurę jeszcze raz.
- Następnie opłucz szpilki 3x w wodzie destylowanej, a następnie osusz szpilki. Powtórz procedurę jeszcze raz.
- Na koniec opłucz szpilki 3x w 95% EtOH, a następnie osusz szpilki. Powtórz jeszcze raz. Zapal szpilkę i pozwól, aby etanol odparował.
- Dodaj substancje chemiczne z 96-dołkowych chemicznych płytek wyjściowych do płytek testowych, przypinając 3x do płytki chemicznej, a następnie przenosząc szpilki 10X do płytki testowej. Zetrzyj na papierze przed roztworem czyszczącym.
- Czyścić przypinacz między płytkami, myjąc w następującej kolejności, osuszając pomiędzy nimi bibułę: 3x w 50% DMSO (raz), 3x w wodzie destylowanej (raz), 3x w 75% EtOH (raz), 3x w 95% EtOH (dwukrotnie). Podpal szpilkę i pozwól, aby etanol odparował.
- Powtórz krok 1.2.2 po zakończeniu przypinania.
nuta: Badanie przesiewowe przeprowadzono przy końcowym stężeniu 60 μM.
- Dodawanie robaków
- Policz liczbę nicieni z pobranej kolekcji, najpierw ponownie zawieszając, a następnie pipetując 5 μl za pomocą końcówek o niskiej retencji na szkiełku w celu obserwacji. Policz liczbę nicieni w 5 μl za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
- Dostosuj stężenie do 2 robaków/μl za pomocą sterylnej wody destylowanej. Za pomocą pipety wielokanałowej i koryta dodaj 10 μl (~20 robaków) do każdego dołka z 96-dołkowych płytek.
nuta: Około 15 000 nicieni D. dipsaci zostanie zebranych na płytkę hodowlaną przy użyciu opisanej metody hodowli i zbierania. Na studnię używa się dwudziestu robaków, ponieważ niewielka liczba ułatwia przejrzystą wizualizację i rozliczanie robaków ruchomych i nieruchomych.
- Zawiń płytki w laboratoryjną folię do pakowania i owiń wilgotnym ręcznikiem papierowym. Umieścić w pudełku i przymocować na lepkiej podkładce w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 200°C ustawionym na 200 obr./min. Upewnij się, że talerze są ustabilizowane w pudełku, dodając dodatkowy wilgotny ręcznik papierowy, aby zapewnić minimalny ruch talerzy.
2. Zbieranie i analiza danych
- Obserwuj płytki w dniu 5 pod mikroskopem preparacyjnym. Policz liczbę ruchomych i całkowitą liczbę D. dipsaci w kontrolach rozpuszczalnikowych DMSO i studzienkach poddanych działaniu leków.
- Jeśli robaki są względnie nieruchome, dodaj 2 μl 1 M NaOH do końcowego stężenia 40 mM do studzienki, aby stymulować ruch.
nuta: Po dodaniu NaOH robaki będą się natychmiast poruszać i należy je obejrzeć w ciągu 5 minut. Liczba robaków mobilnych i całkowita liczba robaków zostaną wykorzystane do obliczenia proporcji robaków mobilnych. Długość testu może się zmieniać w zależności od celu ekranu.
- Oblicz proporcję robaków mobilnych. Na ekranach D. dipsaci studnie, które w sposób powtarzalny dały 0% mobilnych robaków, są klasyfikowane jako silne trafienia.
nuta: Unika się długotrwałej ekspozycji płytek na etapie mikroskopów preparacyjnych, ponieważ źródło światła może podgrzewać płytki i wywoływać zmienny wpływ na test biologiczny.
