Test mineralizacji in vitro: metoda kolorymetryczna do ilościowego oznaczania złogów wapnia w osteoblastach na substytucie przeszczepu kostnego przez barwienie i ekstrakcję czerwieni alizarynowej

Streszczenie

Źródło: Kampleitner, C. et al. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie opisujemy metodę wykrywania złogów wapnia wydzielanych przez osteoblasty za pomocą barwnika anionowego, Alizarin Red S. Wyhodowane osteoblasty są najpierw barwione, a następnie barwnik jest odzyskiwany w celu kolorymetrycznego oznaczania ilościowego depozytów wapnia lub stopnia mineralizacji osteoblastów.

Protokół

1. Test mineralizacji osteoblastów

1. Przed dodaniem osteoblastów (OB) należy wstępnie inkubować krążki fosforanu β-triwapniowego (β-TCP) o średnicy 14 mm w 1 ml pożywki do wzrostu kości (BGM) na 24-dołkowej płytce do hodowli w zawiesinie w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 godziny. Do kontroli należy używać standardowych płytek do hodowli tkankowych, a do próbek biomateriału płytek do hodowli zawiesinowych, aby uniknąć przyczepiania się komórek do tworzywa sztucznego.
2. Zassać pożywkę do wstępnej inkubacji, a następnie ponownie zawiesić pierwotne mysie OB w BGM. Dodać 8,8 x 10⁴ OBs/cm² na wstępnie inkubowane krążki β-TCP na 24-dołkowej płytce do hodowli zawiesinowej oraz, dla grupy kontrolnej, na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej (1 ml/basenik). OB przyczepiają się do płytki hodowli tkankowej lub próbki biomateriału.
3. Zastąp BGM 1 ml pożywki do mineralizacji osteogennej (MM) zawierającej BGM, 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 5 mM β-glicerofosforanu 24 godziny po dodaniu OB i inkubuj przez 14 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni z 1 ml świeżo przygotowanego MM do każdej studzienki.

2. Mineralizacja osteoblastów oceniana przez barwienie czerwienią alizarynową S (ARS)

1. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków zawierających pierwotne OB 14 dni po dodaniu MM i przepłukać dwukrotnie 0,5 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej. Odessać PBS i utrwalić komórki, dodając 0,5 ml 10% buforowanego roztworu formaliny w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Odessać 10% buforowaną formalinę za pomocą jednorazowej pipety i przemyć dwukrotnie 0,5 ml ultraczystej wody.
3. Do utrwalonych OB dodać 0,25 ml 40 mM roztworu barwiącego ARS (pH 4,2) rozpuszczonego w ultraczystej wodzie i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów/min.
4. Odessać roztwór barwiący za pomocą jednorazowej pipety i spłukać 1 ml ultraczystej wody. Powtórz ten krok 5–10 razy, aby usunąć niespecyficzne zabarwienie.
   nuta: Roztwór do płukania powinien być bez koloru.
5. Odessać ultraczystą wodę i dodać 1 ml zimnego PBS. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów/min.
6. Odessać PBS, przenieść poplamione dyski β-TCP do nowej studzienki i zeskanować płytki za pomocą skanera płaskiego, aby zarejestrować mineralizację.
7. Dodać 0,25 ml 10% roztworu chlorku cetylopirydyniowego i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów/min w celu ekstrakcji barwnika ARS.
8. Przenieść supernatanty do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 17 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
9. Do ekstraktów dodać 10% roztwór chlorku cetylopirydyniowego w stosunku rozcieńczenia 1:10–1:20 i dodać próbki (300 μl) do płytki 96-dołkowej, w tym dwóch studzienek ślepych zawierających tylko 10% chlorku cetylopirydyniowego.
10. Przygotować 7 wzorców referencyjnych ARS w zakresie od 4 do 400 μM, rozcieńczając 40 mM roztwór barwiący ARS (pH 4,2) 10% roztworem chlorku cetylopirydyniowego w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.
11. Dodać 300 μl wzorca odniesienia w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej.
12. Odczytać absorbancję próbek, ślepych prób i wzorców odniesienia przy długości fali 520 nm.
13. Odejmij odczyty ślepej próby od wzorców odniesienia i odczytów próbki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
β-krążki fosforanu trójwapniowego (β-TCP, 14 mm)			Dyski spiekano w piecu muflowym w temperaturze 1150 °C. Próbki naświetlano promieniami UV (15 minut z każdej strony) przed użyciem w hodowlach komórkowych
Alizaryna Czerwień S	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5533
Pożywka do wzrostu kości (BGM)			α-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina/streptomycyna
Roztwór formaliny neutralny buforowany 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Chlorek heksadecylopiryny (cetylopirydyny) jednowodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C9002
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy A8960
Pożywka MEM alfa (α-MEM)	Technologie życiowe Gibco	Numer katalogowy: 11900-073
Pożywka do mineralizacji osteogennej (MM)			α-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina-streptomycyna + 50 μg/ml kwas askorbinowy + 5 mM β-glicerofosforan
Penicylina-streptomycyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4333
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
β-glicerofosforan sól disodowa hydrat	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G5422
Woda ultraczysta: woda do hodowli komórkowych bez pirogenów	Firma VWR	L0970-500
96-dołkowa przezroczysta płytka	Greiner bio-one	655001
24-dołkowa płytka do hodowli zawiesiny	Greiner bio-one	662102
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Greiner bio-one	Numer katalogowy: 662160
Wirówka: VWR Mega Star 600R	Firma VWR
Inkubator CO2: HeraCell 240	Thermo Scientific
Skaner płaski: Epson Perfection 1200 Photo	Firmy Epson
Czytnik mikropłytek Infinite M200 Pro	Tecan (tekan)
Probówka do mikrowirówek: Probówka Eppendorfa safe-lock 1,5 ml	Firma VWR	Nr kat. 21008-959
Potrząsanie inkubatorem GFL3032	Język niemiecki	Numer katalogowy: 3032
Pipeta jednorazowa: pipeta do surowicy	Greiner bio-one	612301