Test kiełkowania kulek do oceny angiogenezy we wczesnym stadium: model oparty na kulkach in vitro do badania kiełkowania śródbłonka w obecności perycytów

Streszczenie

Źródło: Azam, S. H. i wsp. Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film przedstawia zmodyfikowany test oparty na kulkach mikronośnika, obejmujący perycyty w celu zbadania kiełkowania śródbłonka we wczesnych stadiach angiogenezy. Test zapewnia eksperymentalny model in vitro w celu zrozumienia molekularnych mechanizmów angiogenezy i wpływu terapii antyangiogenetycznej.

Protokół

1. Przygotowanie koralików do implantacji żelu

1. Weźmy hodowlę zawierającą kulki mikronośnika pokryte ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i perycytami.
2. Zbadaj szalki zawierające kulki pokryte mikronośnikiem pod mikroskopem za pomocą obiektywu 20X, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały wystarczająco pokryte komórkami śródbłonka.
3. Energicznie odpipetować posiany roztwór komórek, aby odłączyć je od płytki o średnicy 6 cm i umieścić roztwór w probówce. Umyj płytkę jeszcze 2 razy pełnym medium i przenieś do tuby, aby zebrać wszystkie resztki kulek, które mogą przykleić się do płytki.
   1. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza i użyj pipety p1000, aby zminimalizować naprężenia ścinające na kulkach pokrytych komórkami śródbłonka.
4. Odczekaj 3 minuty, aby kulki w roztworze osiadły na dnie probówki.
5. Usuń jak najwięcej supernatantu bez naruszania granulki za pomocą końcówki do pipety p1000 (nie używaj aspiratora próżniowego).
6. Dodać 1 ml kompletnej pożywki do każdej probówki i ponownie zawiesić kulki.
7. Odczekaj 30-60 sekund, aby koraliki opadły na dno. Następnie usuń jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety P1000, nie naruszając osadu kulkowego. Nie używaj aspiratora próżniowego, ponieważ prawdopodobieństwo przypadkowego usunięcia granulki kulki jest znacznie zwiększone.
8. Powtórz kroki 1.6 i 1.7 jeszcze dwa razy. Celem jest usunięcie jak największej ilości swobodnie unoszącego się HUVEC, który mógł zostać odłączony od 6-centymetrowej płytki, przy jednoczesnym nie usuwaniu zbyt wielu kulek pokrytych HUVEC, które powinny osadzać się w okrągłodennych probówkach do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) szybciej niż komórki swobodnie pływające.
9. Dodaj 1 ml kompletnego podłoża do kulek.

2. Osadzanie powlekanych kulek w żelu fibrynowym

1. Usuń jak najwięcej pożywki bez naruszania granulki kulki w każdej probówce FACS za pomocą pipety P1000.
2. Ponownie zawiesić kulki w 2,5 ml roztworu fibrynogenu.
3. Odpipetować 13 μl roztworu trombiny do każdego żądanego dołka na 24-dołkowej płytce ze szklanym dnem. Posiewanie w płytce ze szklanym dnem jest niezbędne do optymalnego obrazowania kiełków.
   UWAGA: Nie pozostawiaj trombiny w studzience na dłużej niż 5-10 minut przed następnym krokiem.
4. Dodaj 0,5 ml roztworu kulek/fibrynogenu do każdej studzienki.
   1. Należy pamiętać o ponownym zaparzeniu roztworu kulkowego przed każdorazowym pipetowaniem roztworu.
   2. Należy zachować ostrożność, aby ostrożnie pipetować bezpośrednio do trombiny już obecnej w studzience. Powoli pipetuj w górę i w dół 2-3 razy, aby dokładnie wymieszać roztwór, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.
   3. Pamiętaj, aby wymieniać końcówkę pipety między studzienkami.
   4. Należy zachować ostrożność, aby nie poruszać się ani nie przeszkadzać w płytce w żadnym momencie podczas początkowego krzepnięcia fibryny, ponieważ każdy ruch może zakłócić tworzenie się żelu.
5. Pozostaw płytkę w okapie na 30 minut w temperaturze pokojowej.
6. Ostrożnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na dodatkowe 1,5-2 godziny, aby żel w pełni zastygł

3. Posiewanie fibroblastów na żelu fibrynowym

1. W ciągu ostatnich 30 minut krzepnięcia żelu należy odłączyć normalne ludzkie fibroblasty płuc (NHLF) w następujący sposób:
   1. Przemyć kolbę T175 komórek 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), następnie dodać 5 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
   2. Zawiesić NHLF w stężeniu 20 000 komórek/ml w kompletnych pożywkach.
      UWAGA: Komórki NHLF można hodować za pomocą Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną Streptomycyną.
2. Umieścić 1 ml zawiesiny komórek NHLF na żelu w każdym dołku i umieścić go z powrotem w inkubatorze.
3. Zmieniaj całe podłoża co drugi dzień przez cały czas trwania testu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylne końcówki do pipet	Firma VWR
Pipety	Eppendorf
Kompletny zestaw EGM2 Media Bullet Kit	Lonza	CC-3162	Nośniki HUVEC
Mem	Gibco (firma Gibco)	11095114	Nośniki 10T1/2
DMEM (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	11965118	Materiały medialne NHLF
PBS klasy hodowli tkankowej	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 14190-144	Nie zawiera magnezu i wapnia
Dokładności	Technologie życiowe	A1110501	Do podnoszenia HUVEC
trypsyna	Technologie życiowe	15050065	Do podnoszenia 10T 1/2 i NHLF
HUWEK	Lonza	Zobacz materiał C2517A
10T 1/2	Kontroler ATCC (Kontroler T
Liga NHLF	Kontroler ATCC (Kontroler T
Kulki mikronośne Cytodex 3	Sigma	Zobacz materiał C3275
Płytki 6 i 10 cm powlekane kulturami tkankowymi	Corning
Fibrynogen z osocza bydlęcego	Sigma	Zobacz materiał F8630
Trombiny	Sigma	Zobacz materiał T9549
Aprotynina	Sigma	A3428
Rury okrągłodenne Falcon	Corning
Inkubator do hodowli tkankowych i kaptur
24-dołkowe szklane płyty dolne	MatTek	P24G1.513F	Płytki ze szklanym dnem są potrzebne tylko wtedy, gdy kiełki mają być obrazowane. Jeśli nie, dopuszczalne jest również stosowanie plastiku z kultur tkankowych.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: