Test kontaktu z larwami: procedura oceny śmiertelności larw komarów po bezpośrednim kontakcie z badanym związkiem larwobójczym

Streszczenie

Źródło: Brito-Sierra, C. A., et al. Protokoły testowania toksyczności nowych środków owadobójczych dla komarów J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie opisujemy test kontaktu z larwami w celu oceny toksyczności antagonisty receptora dopaminy, amitryptyliny, na larwach komarów w trzecim stadium rozwojowym, znanych wektorach kilku chorób zakaźnych u ludzi. Ocena śmiertelności larw podczas inkubacji z różnymi stężeniami amitryptyliny w różnych odstępach czasu pomaga określić jej stężenie śmiertelne 50.

Protokół

1. Test kontaktowy z larwami (test dawki pojedynczej lub test odpowiedzi na dawkę)

UWAGA: Test może być przeprowadzony przy użyciu substancji chemicznych rozpuszczalnych w wodzie lub dimetylosulfotlenku (DMSO), pod warunkiem, że końcowe stężenie DMSO w studzienkach testowych nie przekracza 1%. Alternatywne rozpuszczalniki mogą być opcją, ale ważne jest, aby najpierw potwierdzić, że końcowe stężenie nie powoduje więcej niż 10% śmiertelności po 72 godzinach od ekspozycji. Test może być przeprowadzony jako test dawki jednopunktowej lub test dawka-odpowiedź. W przypadku wykonywania tego ostatniego zaleca się przetestowanie zakresu stężeń (co najmniej pięciu), obejmującego oczekiwany LC₅₀.

1. Oznacz studzienki przezroczystej 24-dołkowej płytki tkankowej.
2. Przygotować roztwór podstawowy testowej chemii w probówce o pojemności 1,5 ml.
   1. Zważyć każdą substancję chemiczną za pomocą wagi analitycznej i w zależności od charakterystyki rozpuszczalności, ponownie zawiesić w sterylnym ddH₂O, DMSO lub innym odpowiednim rozpuszczalniku organicznym do wyboru.
      nuta: Obliczenia powinny uwzględniać czystość chemii. Na przykład, aby uzyskać chemię o czystości 99%, rozpuść 10,1 mg w 1,000 μl acetonu, aby uzyskać 1% roztwór. Uszczelnić folią parafinową i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Określić końcowe stężenie badanej substancji chemicznej, która będzie oceniana, i odpowiednio przygotować seryjne rozcieńczenia z roztworu podstawowego, używając odpowiedniego rozpuszczalnika.
   nuta: Stężenie i objętość chemii i rozpuszczalnika można obliczyć za pomocą wzoru C1*V1=C2*V2, gdzie C1 = stężenie próbki 1, C2 = stężenie próbki 2, V1 = objętość próbki 1 i V2 = objętość próbki 2.
   1. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM i seryjne rozcieńczenia zgodnie z wymaganiami w celu uzyskania pożądanych stężeń testowych (Tabela 1B).
4. Za pomocą plastikowej pipety transferowej o szerokim otworze przenieś pięć larw L3 do studzienki płytki do badania kultur tkankowych; Larwy L3 można rozpoznać po długości (~ 2,5 - 3,5 mm) i szerokości torebki głowy ~ 0,025 mm. Delikatnie usunąć wodę pipetą o pojemności 1 ml i zastąpić ją żądaną objętością ddH₂O. Powtórzyć czynność, aby uzyskać n = 4 kontrpróby techniczne na zabieg (tj. łącznie 20 larw na zabieg).
5. Dodaj odpowiednią objętość testowej chemii do każdej z czterech kontrprób w 24-dołkowej płytce testowej i delikatnie obracaj płytką, aby zapewnić równomierne wymieszanie chemii. Umieść płytkę w komorze testowej lub wzrostowej w stałych warunkach (np. Zaleca się 25 °C i ~ 75-85% wilgotności względnej, a jeśli to możliwe, cykl 12 godzin światła/12 godzin ciemności).
   nuta: Aby zapewnić odtwarzalność między eksperymentami, należy upewnić się, że kolejne testy są wykonywane w tych samych warunkach środowiskowych.
6. Zapisać liczbę martwych/niereagujących larw w każdym studzience po 30 minutach, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 i 72 godzinach po ekspozycji (lub w alternatywnych punktach czasowych) na arkuszu wyników (tabela 2). Delikatnie postukaj w bok talerza. Jeśli nie zaobserwujesz żadnego ruchu, delikatnie dotknij larwy sterylną wykałaczką. Larwy, które nie reagują na stukanie/dotyk, należy uznać za "martwe".
   nuta: Można zaobserwować i rejestrować inne fenotypy morfologiczne i behawioralne.
7. W razie potrzeby skorygować śmiertelność kontrolną przy użyciu zmodyfikowanego wzoru Abbotta, w następujący sposób:
   Śmiertelność (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
   gdzie X = procent śmiertelności w próbce poddanej działaniu substancji, a Y = procent śmiertelności w próbie kontrolnej.
8. Wykres wyników jako histogram lub krzywą logarytmiczną za pomocą wybranego oprogramowania, takiego jak Graph-pad Prism 6 lub podobne, i oblicz wartości stężenia śmiertelnego (LC) w stosunku do kontroli.
9. Powtórzyć test, używając oddzielnej partii komarów, aby uzyskać n = 3 lub więcej kontrprób biologicznych.

Tabela 1. Przykładowe obliczenia dla larw Aedes aegypti L3 (A) test dawki pojedynczej i (B) test dawka-odpowiedź.

A. Jednopunktowe testy dawkowe z trzema substancjami chemicznymi
chemia	Stężenie (400 uM)
Amitryptylina	80 mM Zapas: 2 mg amitryptyliny X 98% (czystość proszku) X 0,001 g/1 mg X 1 mol /313,86 g X 1 L/0,08 mol X 106 μL/L = 78,06 μL wody.
	Seryjne rozcieńczenia: Rozcieńczyć materiał 1:2 z ddH2O, a następnie 1:4, aby osiągnąć 10 mM. Dodać 40 μl 10 mM zapasu do studzienki zawierającej 960 μl ddH20, aby osiągnąć końcowe stężenie 400 μM/basenik. Przygotuj seryjne rozcieńczenia zapasu 10 mM 1:2, aby uzyskać zapasy 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM i 0,625 mM.
Cis-(z)-flupentiksol	80 mM Zapas: 2 mg cis(z)flupentiksolu X 98% (czystość proszku) X 0,001 g/1 mg X 1 mol/507,44 g cis(z)flupentiksol X 1L/0,08 mola X 106 μL/L = 48,28 μL wody.
	Seryjne rozcieńczenia: Jak wyżej.
Amitraz	80 mM Zapas: 2 mg Amitraz X 0,001 g/1 mg X 1 mol/293,4 g amitrazu X 1 L/0,08 mola X 106 μL/1 L = 85,21 μL DMSO (uwaga: Amitraz jest rozpuszczalny tylko w DMSO).
	Seryjne rozcieńczenia: Jak wyżej.
B. Test dawka-odpowiedź
Chemia	Dawka 1	Dawka 2	Dawka 3	Dawka 4	Dawka 5
	400 μM	200 μM	100 μM	50 μM	25 μM
np. Amitryptylina, cis-(Z)-flupenthixol oramitraz	40 μL	40 μL	40 μL	40 μL	40 μL
	Zapas 10 mM	Kolba 5 mM	2,5 mM zapas	1,25 mM zapasów	0,625 mM zapasu

Tabela 2. Przykładowy arkusz wyników używany do zapisywania danych z testu dawka-odpowiedź na larwy komarów. Kontrola, tylko woda lub woda z 1% DMSO lub tylko innym rozpuszczalnikiem. Typowe dawki stosowane do badania substancji chemicznych antagonistów małych cząsteczek, takich jak amitryptylina, to 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM i 400 μM.

Test larwalny L3 komara
Data rozpoczęcia:
Badacz:
Gatunek/Szczep:
Typ testu: Jednopunktowa dawka/odpowiedź na dawkę
Śmiertelność (liczba martwych komarów)
Czas (godziny)	Dawka 1	Dawka 2	Dawka 3	Dawka 4	Dawka 5	kontrola
0,5
1
1,5
cyfra arabska
Rozdział 2.5
3
12
24
Rozdział 48
72 Rozdział 72
Procentowa śmiertelność
Czas (godziny)	Dawka 1	Dawka 2	Dawka 3	Dawka 4	Dawka 5	kontrola
0,5
1
1,5
cyfra arabska
Rozdział 2.5
3
12
24
Rozdział 48
72 Rozdział 72

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczepy komarów podatne na insektycydy	Repozytorium referencyjne badań nad malarią i odczynników		https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Zalecane szczepy: szczep Aedes aegypti Liverpool (LVP), Anopheles gambiae Szczep Kisumu (KISUMU1) i szczep Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB)
aceton	Mallinckrodt Chemiczny	CAS 67-64-1	Stosować do rozcieńczania i kontroli
Amitraz powiedział:	Sigma-Aldrich	CAS 33089-61-1	Wymaga rozcieńczenia w DMSO
Amitryptylina	Sigma-Aldrich	CAS: 549-18-8	Może być rozcieńczany w acetonie
Cis-(Z)-flupentiksol	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	Testowany farmakologicznie jako substancja zaburzająca receptory dop-podobne
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	MKBF2985	Rozpuszczalnik organiczny stosowany do rozpuszczania amitrazu
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej z pokrywką	Corning Incorporated	3526
Pipety transferowe	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-711-7 mln	Służy do sortowania larw
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZ6045	Służy do oceny wyników testów larwalnych i wykonywania mikroaplikacji

TGL