$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE
.
1. Kultura dorosłych komarów
UWAGA: Szczepy komarów podatne na insektycydy są dostępne w Repozytorium Badań nad Malarią i Odczynnikami. Zalecane szczepy to: szczep Aedes aegypti Liverpool (LVP), szczep Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) i szczep Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- Hodowla larw komarów z jaj w cyklu 12 godzin dzień/12 godzin nocy w temperaturze 28 °C i wilgotności względnej 75-85% (RH) w plastikowych tacach o wymiarach 25 cm x 40 cm (~ 400 larw na tacę), zgodnie z opisem Nussa. Nakarm larwy mielonym myszoskoczkiem (A. aegypti i An. gambiae) lub płatkowym pokarmem dla ryb (C. quinquefasciatus). W przypadku testów larwalnych należy pobrać larwy w trzecim stadium larwalnym (L3).
- Hodować dorosłe komary z poczwarek, które zostały przeniesione do plastikowych kubków i umieszczać w plastikowych klatkach o pojemności 20 litrów w owadach w warunkach opisanych powyżej. Utrzymuj komary na 20% roztworze cukru, jak opisano w innym miejscu. Dorosłe osobniki zbierać po 3-5 dniach od wschodu.
2. Test miejscowy dla dorosłych (test dawki pojedynczej lub dawki odpowiedzi)
UWAGA: Test miejscowy dla dorosłych jest przeprowadzany przy użyciu acetonu jako rozpuszczalnika. Alternatywne rozpuszczalniki mogą być opcją, ale ważne jest, aby najpierw potwierdzić, że końcowe stężenie nie powoduje więcej niż 10% śmiertelności po 48 godzinach od ekspozycji. Test może być wykonywany jako test dawki jednopunktowej lub test dawka-odpowiedź i służy do określenia dawki śmiertelnej (LD). W przypadku wykonywania tej ostatniej czynności zaleca się przetestowanie zakresu stężeń (minimum pięciu), obejmującego oczekiwany LD50.
- Określ liczbę dorosłych samic komarów wymaganych do przeprowadzenia testu.
nuta: Test dawki punktowej z pojedynczym badaniem chemicznym będzie wymagał co najmniej 90 komarów (30 dla kontroli dodatniej, 30 dla kontroli negatywnej zawierającej tylko aceton i 30 dla chemii testowej).
- Posadź 3 do 5-dniowe dorosłe samice komarów i przenieś je do oddzielnego plastikowego wiadra o pojemności 20 ml za pomocą aspiratora (ryc. 1).
- Oznacz papierowe kubki o pojemności 9 uncji nazwą i stężeniem testowej chemii. Odłóż na bok kwadraty o wymiarach 10 cm x 10 cm i gumki na każdą filiżankę (patrz rysunek 2).
- Wybrać istniejący środek owadobójczy jako kontrolę pozytywną (np. syntetyczny pyretroid, bifentryna) i przygotować 1% roztwór podstawowy (10 μg/μL) w acetonie.
UWAGA: W obliczeniach należy wziąć pod uwagę czystość chemii. Na przykład, aby uzyskać chemię o czystości 99%, rozpuść 10,1 mg w 1,000 μl acetonu, aby uzyskać 1% roztwór. Uszczelnić folią parafinową i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Stosując tę samą procedurę, co powyżej, przygotować roztwór podstawowy testowego roztworu chemicznego.
nuta: Wiele testowych substancji chemicznych jest bardzo labilnych, a roztwory powinny być przygotowywane na świeżo za każdym razem, gdy przeprowadzany jest test biologiczny .
- Przygotować seryjne rozcieńczenia kontroli dodatniej i testowe substancje chemiczne z roztworów podstawowych, jak pokazano na rysunku 3, używając szklanych fiolek o pojemności 20 ml uprzednio przepłukanych acetonem.
- Oczyść szklaną strzykawkę o pojemności 1 ml acetonem, napełnij acetonem i umieść w mikroaplikatorze dostosowanym do objętości 0,25 μl.
- Pracując partiami po dziesięć, wyjmij 3-5-dniowe dorosłe samice komarów z klatek za pomocą aspiratora i znieczulaj przez maksymalnie pięć minut w temperaturze 4 °C w lodówce lub na lodzie. Następnie przenieś komary na szalkę Petriego i ułóż na lodzie na maksymalnie 10 minut.
- Działając szybko, usuń pojedynczą samicę za pomocą cienkiej pęsety i nałóż 0,25 μl roztworu testowego na grzbietową klatkę piersiową za pomocą mikroaplikatora strzykawkowego. Potwierdź dostarczenie chemii poprzez obserwację za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że każdy komar otrzyma odpowiednią objętość testowej chemii.
- Przenieś komara do oznaczonego papierowego kubka spoczywającego na lodzie i powtórz dziewięć razy, aby uzyskać n = 10 leczonych komarów. Zamknij komary w kubku kwadratem siatki zabezpieczonym gumką i przenieś do plastikowej wanny lub komory wzrostowej w stałych warunkach 28 °C i 75-85% wilgotności względnej (preferowany jest cykl 12 godzin w dzień / 12 godzin w nocy).
- Powtórzyć powyższy eksperyment dwukrotnie, aby uzyskać n = 3 kontrpróby techniczne (tj. łącznie 30 komarów) na grupę badaną lub kontrolną.
- Powtórzyć kroki 2.7 - 2.10, najpierw z badaniem chemicznym, a następnie z kontrolą pozytywną.
nuta: Inną przydatną kontrolą, którą należy uwzględnić, jeśli dostępna jest wystarczająca ilość komarów, jest "ślepa próba" 30 znieczulonych komarów, które nie otrzymują ani chemii testowej, ani rozpuszczalnika.
- Zapisz liczbę "martwych/niereagujących" komarów po 30 minutach, 60 minutach, 2, 24 i 48 godzinach po ekspozycji (lub alternatywnych punktach czasowych) za pomocą arkusza wyników (tabela 1). Oceniaj komary jako "martwe/niereagujące", jeśli wykazują brak ruchu, zdefiniowany jako leżenie na boku lub na plecach i niezdolność do latania.
- W razie potrzeby skorygować śmiertelność kontrolną, stosując zmodyfikowany wzór Abbotta w następujący sposób:
Śmiertelność (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
gdzie X = procent śmiertelności w próbce poddanej działaniu substancji, a Y = procent śmiertelności w próbie kontrolnej.
- Wyświetlanie wyników w postaci histogramu lub krzywej wykładniczej. W przypadku testu dawka-odpowiedź należy obliczyć wartość LD50, LD 75 lub LD90 dla badanej chemii w stosunku do kontroli.
- Powtórzyć test co najmniej dwa razy, używając oddzielnych partii komarów w celu uzyskania n = 3 lub więcej kontrprób biologicznych.
